第三章4pcr引物设计

4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条 件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复 性条件最佳。
增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不 影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物 素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结 合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突 变序列和引入一启动子序列等。
一般引物要引入酶切位点
一般还需要引入保护碱基
10.密码子的简并 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的
第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增 特异性与效率。 引物设计还要结合克隆载体的酶切位点 阅读框架 (尤其是要表达时，参考表达载体) 引物上是不是一定要设计加上酶切位点，如果没有 酶切位点，如何连接到载体上去？
二、引物设计实例
PREMIER5设计引物
题目：设计PCR引物将Tspo基因扩增后，能 用双酶切连接到pET28a（+）载体上，并要 求Tspo基因能完整的表达
DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好 避开二级结构区域。用有关计算机软件可以 预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选 择模板。实验表明，待扩区域自由能 （△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不 能成功。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为 20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C） +（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时， 最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适 温度（74℃),不能保证产物的特异性。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的 互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物 间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3’端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何
修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能， 引物3′端不能发生错配。
9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩

Tm温度过高过低会出现问题
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要 有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超 过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C 富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身 会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种 二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的 复性结合。若用人工判断，引物自身连续互 补碱基不能大于3bp。
一、PCR引物设计原则
ＰＣＲ原理
1、引物是否必须是从基因片段起始端开始？
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的 核酸片段，使其能有效地扩增目的DNA序列
十条PCR引物的设源自文库原则总述
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。（如何避免） ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？） ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体） ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5’端可以修饰。 ⑨ 引物3’端不可修饰。 ⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。
1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或
有连续8个互补碱基同源。 有时由于模板的复杂性而无法判断，但尽量避免和
基因内部有过高的同源性 哪些DNA片段可作为模板？GFP在质粒上，和GFP
在基因组上？哪个作为模板，更容易得到专一的 GFP片段？
2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区
Tspo基因序列
atgac tcaatcaaat aataccggaa tactggaaaa gtttgtcaat acagtaatgg gggtaaaaac agaaaatcaa caacagcctt caaatacatt aatcgctact
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1、先查找序列有哪些酶切位点，确定使用哪 几个酶切位点，酶切位点和阅读框架方向？？