第一章植物组织培养的基本技术

培养室
主要工作：将接种的材料进行培养生长的场
所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、 数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利 用空间和节省能源为原则。
具体要求：周围墙壁要求有绝热防火的性
能。培养室温度一般保持在20—27℃左右，安 装空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种 类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养 室。 室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在 70%～80%为好，可安装加湿器。控制光照时 间可安装定时开关钟，一般需要每天光照1016h。
展，取得越来越多的成功。
一、培养基成分
1、水和琼脂
培 养 基 成 分
2、大量元素
3、微量元素
4、铁盐 5、有机质
6、其它辅助性物质
1、水
水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢 过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少 的物质。 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及 培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大 规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸 馏水，以防成分的变化引起不良效果。
6)其它辅助性物质
A. B. C.
抗生物质 抗氧化物 活性炭
A、抗生物质(antibiotic)
2、大量元素
大量元素就是人们平常所说在培养基中的浓度大于
100mg/ L的元素。在植物生命中具有非常重要的作用。 如氮（N）、硫（S）、磷（P）是蛋白质、氨基酸、 核酸和许多生物催化剂即酶的主要或重要组分。它们与 蛋白质、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直
接的不可缺少的关系。
氮占蛋白质含量的16%-18%，在植
第三节 培养基及其配制
主要内容
一、培养基成分
二、培养基的pH
三、培养基的种类、配方及其特点
一、培养基成分
在建立培养系统时，首先找到一合适的培养基。在
植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培
养基的研制史。 对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的 改进，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用 于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发
成分，可影响氧化还原过程。
Mo 是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分。
4、铁盐
铁
是一些酶（氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化 氢酶等）的重要组成成分，又是叶绿素形成的必要条 件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿 有促进作用。 但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀，需 要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常 常把Fe盐单独配制，且以螯合物的形式存在。



在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消 毒等需要各种化学实验用的玻璃器。

包括各种型号的烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、
容量瓶、试管以及移液管架、玻璃棒、滴瓶等。 吸耳球、刷子、记号笔、定时钟、手套、封口膜、 脱脂棉、拖鞋、口罩、白大褂、滤纸。

(三)、湿度
湿度的影响包括培养容器内湿度的保持 和环境的湿度条件。

组培瓶（玻璃）---要求透光度好，能耐高压高 温, 以试管、三角瓶、培 养皿等使用较多。

三角锥瓶--- 适用于各种培养（如固体培养、液 体培养、大规模培养或一般培养）。
培养皿--- 适于作单细胞的固体平板培养、胚和 花药培养和无菌发芽。 试管--- 适合于用少量培养基及试验各种不同配 方时选用。
VB6
VB3 Vc
促根生长
与代谢和胚发育有关 防组织褐变
肌醇（环己六醇）
促进愈伤组织生长以及胚状体和芽的形成
对组织细胞繁殖、分化的促进作用
浓度100 mg/L
氨基酸(aminoacide) 是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收
利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，
其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬
高 压 灭 菌 锅
类型：手提式高 压灭菌锅 立式高压 灭菌锅 作用：培养基、 水和各种器皿 的消毒
种类较多，用
于分离微茎尖可 采用双筒实体解 剖镜。解剖镜上 带有照相装置， 根据需要随时对 所需材料进行摄 影记录。
作用：用于称
取大量元素、 微量元素、 维生素、激 素等药品精 确度 0．0001g。
第1章
植物组织培养的基本技术
第一节
实验室的设计
主要内容
一、植物组织培养实验室设计 二、设备和仪器 三、玻璃器皿及用具 四、培养条件
一、植物组织培养实验室设计
准备间 缓冲室 无菌室
培养室
实验室设计
在进行植物组织培养工作之前，
首先应对工作目的和规模以及需要
哪些最基本的设备和条件有个全面
的了解，以便因地制宜地利用现有 房屋，或新建、改建实验室。
物生命活动中占有首要的地位，故又称
为生命元素。
磷在糖代谢、氮代谢、脂肪转变等
过程中不可缺少。
钾 对于参与活体内各种重要反应的酶 起着活化剂的作用，钾供应充分时糖类合成 加强，纤维素和木质素含量提高，茎秆坚韧， 植株健壮。 硫 氨基酸中都含有硫，这些氨基酸几 乎是所有蛋白质的构成分子。
钙:是细胞壁的组分之一，果胶酸钙是植物细胞胞
琼脂(agar)
作用： 最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子
碳水化合物，本身并不提供任何营养。 特性：溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固 体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶 解于90℃以上的热水。
浓度：琼脂的用量在6-10g／L之间，若浓度太高，培养基
就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。 若浓度过低，凝固性不好。
第二节 器具洗涤
一、 洗涤液 洗涤液的种类很多，配制方法也不一样， 可根据要求选择经济有效的洗涤液。常用 的洗涤剂主要有肥皂、洗衣粉、洗洁精和 铬酸洗涤液等。洗衣粉、洗洁精和肥皂均 是很好的去污剂，对于带油脂太多的玻璃 器皿，可先用其他洗涤液除污垢再用洗衣 粉水等洗涤。
二、各种器具的洗涤 新器皿；新购置的玻璃器皿一般都有游离的碱性 物质，使用前要在1%的盐酸溶液中浸泡24h再清 洗，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水洗2～3次彻 底清洁后，烘干备用。 用过器皿；用过后玻璃器皿如烧杯、试管和培养 瓶等要先除去其残渣，清水冲洗后将器皿放入洗 衣粉溶液中浸泡一段时间，然后涮去器皿内污物， 如洗涤效果不好，可增加洗衣粉水浓度或适当加 热，器皿内外都要刷到，再用水冲洗干净，最后 用蒸馏水冲洗一遍，干燥后备用。
主要设备 ：培养架、空调机、除湿机、
摇床、培养箱、紫外光源等。
二、设备、仪器
(一)大型设备和仪器
大多由铝合金制成， 一般设5-7层，最低一 层离地高约2Ocm，其他 每层间隔30cm左右，培 养架即高2左右。培养 架长度都是根据日光灯 的长度而设计， 如采 用40W日光灯，长1.3m， 宽度一般为60cm。
具体要求：
接种室宜小不宜大，一般7～8平方米，要求 地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清 洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空 气扰动。 接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当 位置吊装1～2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。 最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使 门窗紧闭，减少与外界空气对流。
间层的主要成分，缺钙时细胞分裂受到影响，细 胞壁形成受阻，严重时幼芽、幼根会溃烂坏死。 镁 是叶绿素分子结构的一部分，缺少镁，叶绿素 就不能形成，叶子就会失绿，就不能进行光合作 用。镁也是染色体的组成成分，在细胞分裂过程 中起作用。
3、微量元素
B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是 植物组织培养中不可缺少的元素，缺少 这些物质会导致生长、发育异常现象。 微量元素 指小于100mg/L的元素。
实验室的大小取决于工作的目的和规模：
1. 以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会 限制生产影响效率。 2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来 设计 避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做 到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还 需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
培 养 架
用于植物 材料的培养， 其内有温度感 受器，控制箱 内温度到所调 指标。生化培 养箱还配有光 照装臵。
恒温培养箱
超 净 工 作 台
用于培养物的无 菌操作（由鼓风 机、滤板、操作 台、紫外灯和照 明灯组成）。
超净台分水平式 和垂直式二种型 号
烘 箱
用于干燥洗净的 玻璃器皿，也可用 于干热灭菌和测定 干物重.用于干燥 需 保 持 80-100℃ ； 进行干热灭菌需保 持 150℃ ， 达 1-3h ； 若测定干物重，则 温度应控制在80℃ 烘干至完全干燥为 止。
一般使用浓度在10％-20％
在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。
2)香蕉
浓度：150-200ml/l。用黄熟的小香蕉， 加入培养基后变为紫色。 对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织 培养中应用，对发育有促进作用。
3)马铃薯(potato)
去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤， 取其滤液使用。 用量为150-200g／L。 对pH值缓冲作用也大。添加后可得 到健壮的植株。
电子天平
作用：测定培养基及酶制剂的ｐＨ值
酸 度 计
作用：低温
保存材料， 存放药品、 培养基母液、 激素、酶制 剂。
冰 箱
空 调 机
一般要保持 在23—27℃ 左右，具备 产热装置， 并安装吊式 或立式空调 机。
(二）小型用品
1．镊子类(forceps) 常应用医疗上的镊子。 根据操作需要有各种类型 2．剪刀类(scissors) 可采用医疗五官科用的 中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可 以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到 瓶口中进行剪切。
3. 解剖刀: 切割较小材料和分离茎尖分生组织 时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保 持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起 周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。
4. 解剖针: 解剖针可深入到培养瓶中，转移细 胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶， 可以自制。 5. 接种盘:
三、玻璃器皿及用具
菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入 杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，以 照射灭菌。
无菌室
(也叫接种室，操作室)
主要工作：用于植物材料的消毒、接种、培
养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以 及一切需要进行无菌操作的技术程序。
主要设备：紫外光源、超净工作台、显微镜、
解剖镜、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、 解剖刀、接种针）等。
5、有机质----糖
不同糖类对生长的影响不同。从各种糖 对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最 好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同 植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时
要根据配方规定按量称取，不能任意取量。
维生素(vitamin)
种类： VB1 (盐酸硫胺素) 、 VB6 (盐酸吡哆醇) 、VB3(烟酸) 、 Vc (抗坏血酸)，有时还使用生物素、叶酸、核黄素等。 浓度： 0.1－1.0mg/L 作用： VB1 促愈伤组织产生，提高活力
氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。
6、其它辅助性物质
为了特殊的培养目的，在一部分培养基中 还添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解 乳蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西红 柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁等天然复合物 以及活性炭，渗透调节剂等。
1)椰乳
是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果
最大的一种天然复合物。

。
准备室 接种室
培 养 室
缓冲间
准Fra Baidu bibliotek室
主要工作：完成完成各种器具的洗涤、干
燥、各种药品 贮备、称量、溶解、配制、培 养基分装、培养基的灭菌等。
主要设备：水池、工作台、高压灭菌锅、烘
箱、药品柜、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度 计及常用的培养基配制用玻璃仪器.
缓冲室
具体要求和工作：面积5m2为宜。进入无
Mn 对糖酵解中的某些酶有活化作用。 B 影响植物的有性生殖如花器官的发育和
受精作用。还具有抑制有毒的酚类化合物
的形成的作用，改善某些植物组织的培养
状况，缺硼时细胞分裂停滞，愈伤表现出
老化现象。
Zn 是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脱
氢酶、乙醇脱氢酶等的活化剂。
Cu 是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的
4)水解酪蛋白或水解乳蛋白
为蛋白质的水解物，主要成分为氨基
酸（含有约20种氨基酸的混合物） 使用浓度为100-200mg／L。受酸和酶 的作用易分解。
5)其他
酵母提取液(YE)(0.01％-0.05％)，主 要成分为氨基酸和维生素类； 麦芽提取液(0．01％-0．5％) 苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟 玉米的胚乳等。