基因检测案例17-红绿色盲

疾病简介-红绿色盲

人类视网膜含约1亿个视杆细胞和600万个视锥细胞。视杆细胞主要分布于视网膜周边部，其功能主要是暗环境下的周边视力，视锥细胞主要分布在黄斑部，特别是中心凹区，主要发挥色觉辨识、明视环境下的中央视力和精细视力。

正常人视锥细胞中含红、绿、蓝视锥蛋白，可辨别红、绿、蓝三色，即三色视。色觉异常主要分为以下几类：

红绿色盲患者不能区分红色或绿色即双色视，临床上较常见。呈X连锁隐性遗传。男性患病率为2％～8％，女性患病率为0.4％～1.7％。

基因介绍-OPN1LW和OPN1MW基因

编码人类红-绿视蛋白的基因位于X染色体的Xq28区域上，其基因分别为OPN1LW（红视蛋白基因）和OPN1MW（绿视蛋白基因）。基因或者其启动子区域异常会导致红绿色盲，即对长波长和中波长敏感的感光色素无法产生相应色觉信号。

两基因相邻，串联排列且具有高度相似性（约98% DNA序列相同）。由于其结构高度相似且位置相邻，导致红／绿视蛋白基因易于发生不平等的同源重组。

减数分裂时，同源红绿视蛋白基因联会时就可能发生连锁互换，导致视蛋白基因数量改变（A）或产生新的红绿混合基因（B）

基因座控制区（LCR）与红色视蛋白或第一个绿色视蛋白基因的启动子交联，可驱动转录并促使视网膜中形成红色或绿色视锥。远端绿色视蛋白基因中的复制和终止突变，该情况对色觉无影响，因为远端拷贝基因很少在视网膜中表达。

大约25%的男性白种人有一个OPN1MW基因，而50%的人有两个OPN1MW基因，其余的人有3个或更多的OPN1MW基因。多个OPN1MW拷贝序列相同，且间距较远，间隔序列相同的TEX28假基因。

OPN1LW和OPN1MW基因均包含6个外显子，通过CDS区比对可以看到，两个基因序列高度相似。

OPN1LW和OPN1MW基因外显子1、3、6序列完全一致，外显子2、4、5上仅有少量碱基差异。基因变异

HGMD数据库中收录的OPN1LW和OPN1MW基因变异中，大片段缺失、复杂重排占多数，约2/3，错义突变、无义突变、小片段插入/缺失、剪切位点变异等占少数，约1/3。

检测难点

(1) OPN1LW（红视蛋白基因）和OPN1MW（绿视蛋白基因）序列高度相似。

(2) 基因间隔序列高度相似且片段较大。

(3) OPN1MW（绿视蛋白基因）存在多个拷贝，但仅第一个拷贝会影响表型。

(4) 常规一代测序和二代测序均无法实现变异检测，而三代测序成本太高。

检测方案

基于OPN1LW和OPN1MW基因的序列高度相似性及变异特点，确定的检测方案如下：

(1) 外显子通用引物

分析Exon1-6区域内是否有错义突变、无义突变、小片段插入/缺失、剪切位点变异；分析是否存在基因缺失。

(2) 外显子特异性引物

分析基因检测区域内是否有缺失；荧光定量PCR法分析基因数量或可能存在的融合情况；测序法检测区域内的变异。

(3) 长片段特异性引物

分析基因扩增区域内是否存在缺失；测序检测区域内变异；验证可能的基因融合形式。(4) 长片段通用引物

分析基因的排列顺序。

案例分析

临床诊断

受检者，女，32岁，临床表型正常，其父亲色弱。

检测项目

眼科遗传病基因检测（441个基因）及红绿色盲基因OPN1LW、OPN1MW变异检测。

检测方法

方法：从受检者外周血中提取基因组DNA，构建基因组文库，通过探针杂交捕获相关的目的基因外显子及相邻内含子部分区域，进行富集。富集的目的基因片段通过高通量测序平台测序，对明确的致病性变异，采用Sanger测序进行验证。OPN1LW、OPN1MW基因变异检测采用实验室自建的检测方法。

检测结果

检出一个与受检者父亲临床表型匹配的致病性基因变异：

备注：按照美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）制定的遗传变异分类标准，变异分为以下5种类型，Pathogenic表示致病的变异；Likely pathogenic 表示可能致病的变异；Benign 表示良性的变异；Likely benign 表示可能良性的变异；Uncertain significance 表示意义不明确的变异。AD 表示常染色体显性遗传；AR 表示常染色体隐性遗传；X-linked 表示X连锁遗传。

遗传解析

(1) OPN1MW（OMIM:300821）基因变异常导致绿色盲，以X连锁隐性方式遗传。

(2) 受检者父亲携带半合子变异：OPN1MW entire gene del，此变异已被HGMD数据库收录，已有文献报道为致病变异。

(3) 受检者理论上应为杂合携带者。

一代测序结果

OPN1MW entire gene del，受检者父亲携带半合子变异，受检者理论上应为杂合携带者。

参考文献

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