构建胰岛素基因工程菌

R
C
人胰岛素原表达法
获取人胰岛素cDNA，克隆在含有P 获取人胰岛素cDNA，克隆在含有Ptac和β-gal基因 gal基因 的表达型载体上，两基因通过Met的密码子连接 的表达型载体上，两基因通过Met的密码子连接 通过CNBr裂解法回收胰岛素原蛋白 通过CNBr裂解法回收胰岛素原蛋白 体外折叠
构建胰岛素工程菌
前言： 前言： 胰岛素的发现 胰岛素的结构 重组人胰岛素及类型
重组人胰岛素基因工程菌的构建： 重组人胰岛素基因工程菌的构建： Construction of the ecotin(大肠杆菌素 大肠杆菌素)–proinsulin 大肠杆菌素 expression plasmid Construction of pEGP1 plasmid
1 翻译后不需要糖基化修饰，在细菌内合成 翻译后不需要糖基化修饰， 的胰岛素具有完整的生物活性。 的胰岛素具有完整的生物活性。 2 胰岛素是一个相对较小的分子，由两条多 胰岛素是一个相对较小的分子， 肽链组成，一条含21个氨基酸 个氨基酸（ 链 肽链组成，一条含 个氨基酸（A链）和另 一条含30个氨基酸 个氨基酸（ 链 一条含 个氨基酸（B链）。
N≤3
重组人胰岛素基因工程菌的构建
重组前胰岛素
Chain B
Chain C
Chain A
人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
tac
Met β-Gal
转化
Apr Met B peptide C peptide A peptide ori N 人胰岛素原的cDNA 重组人胰岛素原 M M C
分离纯化
[2]
Current Protocols in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc. Chapter 1 Escherichia coli, Plasmids, and Bacteriophages Section II Vectors Derived from Plasmids Unit 1.5 Introduction to Plasmid Biology Figure 1.5.11
Materials
1.Restriction enzymes from NEB and MBI Fermentas 2.PCR purification and gel extraction kits from Qiagen 3.pCR-Blunt II-TOPO kit and from Invitrogen Top10 competent cells 4.E. Coli BL21(DE3)Gold from Stratagene 5.E. coli GM2163 (dam- and dcm- ) from NEB 6.E. Coli SF120 from Prof. George Georgiou’s laboratory 7.Bovine trypsinogen and thrombin from Sigma 8.HisTrap FF crude and from Amersham HiTrap NHS-activated HP columns 9. Antibodies used for ELISA from Roche 10. Standard Human proinsulin from NIBSC R ELISA plates 11. Maxisorp from Nunc,Copenhagen. 12. Protein mass standard PeqGold used for SDS–PAGE from Peqlab TM marker from Invitrogen 13. Mark12 14. NuPAGE (4–12%) Bis–Tris gels from Invitrogen 15.ZipTipC18 from Millipore from Pierce 16. Micro BCATM protein assay kit 17. RP-HPLC Nucleosil C18 column from Macherey Nagel, Germany
digest
Sal I
digest
the pepsinogen fragment was removed encoded E. coli ecotin
purify.
dephosphorylate and purify.
ligate
pEG-PI
E.coli BL21(DE3)Gold
pET-20b
From
重组人胰岛素
1.Humulin 优泌林） （优泌林）
Eli Lilly and Company
1982年10月在美国上市，全球第一 年 月在美国上市 月在美国上市， 个商业化基因重组人胰岛素。 个商业化基因重组人胰岛素。 2.Novolin 诺和灵） （诺和灵）
Novo Nordisk
欧洲市场的重组胰岛素类似物
Construction of the ecotin–proinsulin expression plasmid
pET 20b-proinsulin The source of proinsulin gene forward primer PCR pCR-Blunt II-TOPO kit reverse primer
胰岛素的发现
1922 Frederick Banting Charles Best
人胰岛素一级结构
CHAIN A: 21 amino acids CHAIN B: 30 amino acids
胰岛素立体结构
胰岛素具有两个利于通过DNA重组技术生产的特 重组技术生产的特 胰岛素具有两个利于通过 点：
人胰岛素原表达法
表达产物的后处理路线：
R
C peptide
R R
百度文库
B链中第22位上的Arg和第 29 位上的Lys由于良好折叠 的原因，对胰蛋白酶不敏感 的原 因，对胰蛋白酶不敏感
N
S S C S
K
A peptide
S
S
M
S
B peptide CNBr
S S N C S S N S S
R
胰蛋白酶
羧肽酶B
胰蛋白酶
去除C 去除C链，余下完整的A链和C末端带一Arg的B链 余下完整的A链和C末端带一Arg Arg的
羧肽酶
获得人胰岛素 结果：由于有C链的存在，胰岛素原在体外能形成天然 结果：由于有C链的存在， 的空间构象，使得正确折叠率达80％，成本为$50/g ％，成本为 的空间构象，使得正确折叠率达80％，成本为$50/g
EcoR I
5' ... G^A A T T C... 3' 3' ... C T T A A^G ... 5'
E. coli GM2163 (dam- and dcm- ) dam dcm:甲基转移酶 甲基转移酶 保护DNA序列不被甲基化，提高限制性内切酶正确识别酶切位点的机率 序列不被甲基化， 保护 序列不被甲基化 E.coli BL21(DE3)Gold More Like a Mammal produce an increased amount of rare E.coli tRNAs that correspond to codons used more frequently by other organisms. This modification overcomes expression problems due to codon bias[1] . 提高E.coli tRNAs 结合在其他生物体里广泛使用但在E.coli中很少使用的密码 提高 结合在其他生物体里广泛使用但在 中很少使用的密码 子的机率。 子的机率。 克服了密码子偏爱性造成的表达问题。 克服了密码子偏爱性造成的表达问题。
From page 11 to 13 and 15
Ajamaluddin Malik , Marco Jenzsch , Andreas Lubbert ,Rainer Rudolph , Brigitte Sohling Protein Expression and Purification 55 (2007) 100–111
reverse primer
forward primer
forward primer
PCR
PCR
pCR-Blunt II-TOPO kit
pTrc99a
EcoR I-BspE I BspE I-Sal I EcoR I-Sal I purified by agarose gel electrophoresis
sequence transform E. Coli GM2163(dam- and dcm- )
pEGP1
(containing the ecotin-pepsinogen fusion protein gene)
(胃蛋白酶原)
transform
E. coli GM2163 (dam- and dcm- ) BspE I BspE I Sal I
pCR®-Blunt II TOPO®
Restriction enzymes
BspE I
5' ... T^C C G G A ... 3' 3' ... A G G C C^T ... 5'
Sal I
5' ... G^T C G A C ... 3' 3' ... C A G C T^G ... 5'
重组人胰岛素类型
1.重组前胰岛素 重组前胰岛素
Chain B Chain C Chain A
2.A,B链分开表达 链分开表达
+
Chain B Chain A
3.B-miniC-A 重组表达
Chain B
Mini Chain C
Chain A
4.B-XXX-A 重组表达 X为氨基酸 为氨基酸
Chain B X1X2Xn Chain A
Construction of pEGP1 plasmid
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E. coli JM83
The source of ecotin gene
pHQPEX-30-5[1]
The source of pepsinogen 5’ end (Gly-Ser)3 Primer 3’ end of pepsinogen (His)6 primer
sequence of primer
forward primer
5’-GGT TCC GGA TCT GGT TCT GGT TCT CTG GTC CCC Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu Val Pro CGC GGT AGT CAC CAC CAC CAC CAC CAC CGT TTT GTG Arg Gly Ser His His His His His His Arg AAC CAA CAC CTG TGC GGC-3’ Proinsulin
reverse primer
5’-AGT GTC GAC TTA GTT GCA GTA GTT CTC CAG CTG GTA-3’ Ter Proinsulin TCC GGA BspE I GTC GAC Sal I
Schematic presentation of the ecotin-proinsulin fusion protein cloned in pTrc99a
pEGP1 pTrc-eco-peps (abbreviated as pEGP1) Express pepsinogen fused to E. coli ecotin[1]
pTrc99a
T7表达系统
IPTG诱导 诱导
[1]:vorgelegt der A novel strategy for the periplasmic production of heterologous proteins in E. coli
1-21：E. coli ecotin signal sequence 22-162： E. coli ecotin 163-174：(Gly Ser)6 linker 175-180: LVPRGS 181-186: (His)6 187: Arg 188-273: Proinsulin trypsin(胰蛋白酶) cleavage site thrombin(凝血酶) cleavage site