五、 体外分析技术

第五章体外分析技术

第一节放射免疫分析的基本原理

放射免疫分析的基础是抗原和相应的抗体能进行特异

性结合。放免分析体系中有两种抗原，即未标记抗原（Ag)和标记抗原（*Ag),两者都与抗体（Ab）有相同的结合能力，且两者的总和大于抗体的量，两种抗原与抗体的结合将彼此竞争，互相抑制。反应体系中每管所加*Ag和Ab量相同，而Ag量不同，随着Ag量的增加，*Ag与Ab的结合（B）将减少，经实验和理论证明，B与Ag量成函数关系。

在实际的反应体系中有两种Ag，即已知成梯度浓度的一系列标准品和未知浓度的待测样品，两者在严格相同的条件下与*Ag及Ab反应，反应结束后，以标准品的浓度为横坐标，结合率为纵坐标，绘制出标准曲线。再以待测样品的结合率从标准曲线上查出其含量来。

第二节放射免疫分析法的建立和基本试剂

（一）抗体衡量抗体的指标有（1）抗体的亲和力，（2）抗体的特异性，（3）抗体的滴度。

（二）标记抗原对标记抗原的要求是（1）标记后保持抗原的生物特性；（2）有效期较长；（3）比活度和放化纯度要高。（三）标准品对标准品的要求是（1）含量要准确，（2）与待测样品的抗原特性相同,(3)不含干扰反应的物质。

（四）基本操作过程

1.在试管内加入Ag（包括标准品和待测样品）*Ag和Ab。

2.温育。

3.分离游离抗原和抗原抗体复合物。

4.测抗原抗体复合物的放射性。

5.数据处理。

第三节分离方法和数据处理

一、分离方法

1.中止反应后收集抗原抗体复合物测放射性(B) 常用方法有以

下几种:

(1)聚乙二醇(PEG)沉淀法。（2）双抗体沉淀法。（3）葡萄球菌A蛋白沉淀法。（4）其它。

2.收集游离抗原测放射性(F) 常用活性炭吸附法.

3.固相法将抗体吸附于固相支持物上,当反应达到平衡后,抗原抗体复合物就留在支持物上,倒去上清液,再洗涤数次,测定固体支持物上的放射性B。

（二）数据处理

1.手工作图法根据标准管测得的数据算出结合率，以标准品浓度为横坐标，结合率为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2.计算机数据处理由计算机根据预先设定的函数公式对数据

进行处理，绘制曲线并算出样品管的含量。

第四节质量控制

（一）质量控制的目的

质量控制的目的是在操作中避免一切可能产生的误差，使结果尽可能地确。

（二）放射免疫分析误差

放射免疫分析误差可分为系统误差和随机误差。系统误差是因发生了某一系统变化，使整批结果受到影响。随机误差属随机现象，仅影响一管或几管。

（三）质量控制的指标

1稳定性常用以下指标来观察。

（1）最大结合率指零标准管的结合率，一般要求在30-50%。（2）非特异结合率（NSB）不加抗体时标记抗原和非特异物质的结合率，一般要求<5%-10%。

（3）标准曲线直线回归参数截距a，斜率b和相关系数r,要求a、b稳定，r>0.99。

（4）ED25、ED50及ED75 即标准曲线的结合率在零管结合率的25%，50%，75%时横坐标上相应的抗原浓度值。

2精密度指同一样品重复测定的实测值的离散程度。即复管的重复性。

3灵敏度灵敏度就是放免方法能测定的用统计学方法能与零

剂量相区别的最小量。

4准确度是指样品的测定值与真值相差的程度。由于样品的真值是未知的，常用的估计准确度的方法有:

（1）质量控制样品。

（2）测定标准品的回收率。

第五节免疫放射分析法

一、基本原理免疫放射分析是以过量的标记抗体（*Ab）与抗原起反应，反应结束后，分离除去多余的游离抗体，测抗原和标记抗体复合物的放射性，此抗原抗体复合物的放射性与抗原的含量成正相关，可用标准品的结合率绘制标准曲线，再用样品的结合率从标准曲线上查出相应的待测抗原浓度。

二、基本方法

（一）双抗体夹心法待测抗原的一个抗体先与固体支持物结合，加入待测物液体反应，使待测物抗原与固相抗体结合后再加入*Ab与抗原结合，再洗去未结合抗体，测复合物的放射性。

（二）标记第三抗体法这种方法是将125I标记在第三抗体上，即夹心法中标记抗体不再标记，而标记的第三抗体是针对该抗体的，此标记的第三抗体具有多用性。

三、数据处理和质量控制免疫放射分析数据处理也可用手工作图法和计算机数据处理，其质量控制也和放射免疫法相似。