质粒DNA的提取分子生物学实验
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• 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之 下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的 药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增 至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒， 要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达 的质粒(运载工具)。
注意：
• 用移液器操作时，每一步都要格外小 心，特别是在加入溶液II 和III后， 一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包 括质粒DNA和基因组DNA)！！！
质粒小量提取的方法（手工提取）：
1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml 含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小 时;
具备的条件： • 易于鉴定； • 在受体细胞中可以独立复制； • 易于筛选； • 易于导入受体细胞。
载体Fra Baidu bibliotek结构：
1. 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会 导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、 尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复 性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞 裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌 细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒 DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放 出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。 然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中 性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分 子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中， 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底 部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出 来。
细菌裂解的方法：
• 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS • 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 • SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒
大量提取。
3. 材料与试剂 材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5α。
pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc 尾 ，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵 母双杂交结果。
质粒DNA的提取
分子生物学实验
1. 目的与要求
通过质粒的一些特性、质粒DNA 的提取、测定，学习用碱变性法 提取质粒DNA的方法，掌握碱裂 解法提取质粒DNA的原理及操作 。
2. 相关知识及原理
质粒(Plasmid) ：
独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标记基因(Marker gene, such as LacZ
gene)。
Insert
EcoRI 1.9kb
XhoI
原理：
4. 加入150 m l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混 匀，冰上放置5min;
5. 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入 另一干净离心管，并加1ml 100％乙醇混匀， 12000r/min离心5min，弃去上清液;
6. 沉淀用0.5ml 70％乙醇清洗一次， 12000r/min离心 5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙 醇，室温自然干燥;
溶液2－0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，
28.5mL H2O
TE缓冲液或水（+ 20mg/ml RNase ）:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇
7. 加入30-50ml含有20mg/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分 溶解(有时需要酚:氯仿抽提);
8. 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。
Biodev（博大泰克）质粒快速提取 试剂盒（plasmid rapid isolation kit）
2. 取 液 体 培 养 液 1.5-3ml 于 Eppendorf 管 中 ， 10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100ml溶 液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟;
3. 加入200ml新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（变性 液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。
DNA超螺旋结构
细菌质粒:
细菌质粒是用的最多的质粒类群， 其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用 宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组 酶系。
质粒类型：
• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个 细胞中只有一份或几份拷贝；
碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。
使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液中按 1:3的比例加入无水乙醇。
•Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains.
•Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts.
•E. coli replication origin: pUC
•Copy number: ~500
Insert
EcoR1 1.9kb
Xho1
pCMV-Myc-T10
4. 步骤 A.质粒DNA的提取
碱裂解法
溶液1－GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。
载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达 的质粒(运载工具)。
注意：
• 用移液器操作时，每一步都要格外小 心，特别是在加入溶液II 和III后， 一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包 括质粒DNA和基因组DNA)！！！
质粒小量提取的方法（手工提取）：
1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml 含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小 时;
具备的条件： • 易于鉴定； • 在受体细胞中可以独立复制； • 易于筛选； • 易于导入受体细胞。
载体Fra Baidu bibliotek结构：
1. 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会 导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、 尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复 性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞 裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌 细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒 DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放 出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。 然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中 性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分 子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中， 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底 部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出 来。
细菌裂解的方法：
• 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS • 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 • SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒
大量提取。
3. 材料与试剂 材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5α。
pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc 尾 ，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵 母双杂交结果。
质粒DNA的提取
分子生物学实验
1. 目的与要求
通过质粒的一些特性、质粒DNA 的提取、测定，学习用碱变性法 提取质粒DNA的方法，掌握碱裂 解法提取质粒DNA的原理及操作 。
2. 相关知识及原理
质粒(Plasmid) ：
独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标记基因(Marker gene, such as LacZ
gene)。
Insert
EcoRI 1.9kb
XhoI
原理：
4. 加入150 m l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混 匀，冰上放置5min;
5. 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入 另一干净离心管，并加1ml 100％乙醇混匀， 12000r/min离心5min，弃去上清液;
6. 沉淀用0.5ml 70％乙醇清洗一次， 12000r/min离心 5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙 醇，室温自然干燥;
溶液2－0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，
28.5mL H2O
TE缓冲液或水（+ 20mg/ml RNase ）:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇
7. 加入30-50ml含有20mg/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分 溶解(有时需要酚:氯仿抽提);
8. 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。
Biodev（博大泰克）质粒快速提取 试剂盒（plasmid rapid isolation kit）
2. 取 液 体 培 养 液 1.5-3ml 于 Eppendorf 管 中 ， 10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100ml溶 液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟;
3. 加入200ml新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（变性 液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。
DNA超螺旋结构
细菌质粒:
细菌质粒是用的最多的质粒类群， 其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用 宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组 酶系。
质粒类型：
• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个 细胞中只有一份或几份拷贝；
碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。
使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液中按 1:3的比例加入无水乙醇。
•Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains.
•Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts.
•E. coli replication origin: pUC
•Copy number: ~500
Insert
EcoR1 1.9kb
Xho1
pCMV-Myc-T10
4. 步骤 A.质粒DNA的提取
碱裂解法
溶液1－GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。