cDNA第二链合成

1. Superscipt II―RT合成第一链:

1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入

xul mRNA(大约500ng)

1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)

(5’

GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGT CTCGAG TTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x ul RNase-free water

（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）

2. 混匀后,70℃反应10分钟;

3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;

4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:

4ul 5×first strand buffer

2ul 0.1M DTT

1ul 10mM dNTP(自己配制)

5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;

6. 反应完成,趁热加入1 ul S uperscipt II―RT,混匀;

7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.

2. cDNA第二链的合成 :

1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):

20ul 10×DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP(自己配制)

xul dd H2 O

1ul RNase H(2U/ul)

10ul DNA Polymerase I(10U/ul)

总体系为200ul;

2. 混匀后,16℃反应2.5小时;

3. 70℃灭活10分钟;

4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;

5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。

注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。

3. 双链cDNA末端补平 :

1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):

6ul 10mM dNTP

2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)

2ul BSA(10mg/ml)

2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;

4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;

5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;

6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;

7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;

8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.

注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

PCR纯化试剂盒操作流程：

1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。

2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。

3．加入spin column中，13000rpm离心1min。

4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。

5．13000rpm，再离心1min。

6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。

7．13000rpm离心2min。

8．加入30ul buffer EB，静置10min。

9．13000rpm离心2min。

10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

4 EcoR I adaptor 加接:

1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;

2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:

1.2ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)

3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;

5双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切:

1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;

2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:

1ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

6ul dd H2 O

1ul T4 PNK(10U/ul)

3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;

4. 稍微离心使反应物集中至管底;

5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:

4ul Xho 10×Buffer

2ul BSA

5ul ddH2O

8ul Xho I (10U/ul)

6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;

7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

6.胶回收cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒)

1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶

2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。

3．电泳50V；1hr

4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。

5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）

6．50℃水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII

7．50℃水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮

8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）

9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬

10．离心并去上清（同操作8）

11．加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清

12．再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清

13．超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14．取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。

15．将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。

注意事项：