琼脂糖凝胶电泳实验报告
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实验一:琼脂糖凝胶电泳对DNA提取
实验目的:学习使用水平式琼脂糖凝胶电泳进行DNA勺提取。
实验原理:琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有
一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。根据DNA分子量不同,采用外加电场使其分开,用生物染料嵌入DNA分子后在紫外下显色。
1)在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下,带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖——磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
2)在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,
即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。
3)生物染料在紫外光照射下能发射荧光,当DNA羊品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时,生物染料从正极向负极移动,就会嵌入
DNA分子中形成络合物,使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在生物染料足够的情况下,荧光的强度正比于DNA勺含量,这样就可以检测DNA勺浓度。
实验材料:微量移液器(2卩l和4卩I),高压灭菌锅,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置,微波炉等。TAE电泳缓冲液,琼脂糖凝胶,PCR 扩增样品
实验步骤:
1胶液的制备:称取0.2g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入20ml TAE稀释缓冲液,放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化,沸腾。取出摇匀。加热时应盖上封口膜, 以减少水份蒸发。
2胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用透明胶带(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上, 插上样品梳子。
3向冷却至50-60 C的琼脂糖胶液中小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。检查有无气泡。
4 室温下约20 分钟后,琼脂糖溶液完全凝固,小心垂直拔出梳子和挡板,注意不要损伤梳底部的凝胶,清除碎胶。将凝胶放入电泳槽中。
5加入电泳缓冲液(TAE至电泳槽中,使液面高于胶面约1mm
6加样:取2卩IPCR样品与2卩l缓冲液液混匀,用微量移液枪小心
加入样品槽中。小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
7电泳:加完样后,插上导线,打开电泳仪电源,按照需要调节电压至160V,电泳开始,观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。
8当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时,将电压(或电流)回
零,关闭电源,停止电泳。
9取出凝胶,在紫外观测仪上观察电泳结果。在波长为302nm紫外
灯下拍照观察。
实验结果:利用琼脂糖凝胶电泳实验做的图如下:
结果分析:通过跑胶结果可以看出DNA勺分离效果都很好,无
断裂,浓度可观,点样位置为第一排第16个,即第一排最后一个。与Mark的对照有相吻合的条带,可进行下一步的判断与分析。
注意事项
1确保实验全程无污染
2缓冲系统:在没有离子存在时,电导率最小,DNA不迁移,或迁移极慢,在高离子强度的缓冲液中,电导很高并产热,可能导致DNA变性,因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时,常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
3 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的
凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,影响电泳结果。
4样品加入量:加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖
尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。
5电泳系统的变化会影响DNA的迁移,加入DNA标准参照物进行判定是必要的。