总大肠菌群的检验

《环境工程微生物学》

实验报告

实验名称：总大肠菌群的检验

专业：环境科学

班级：环科111

学号： 1108100069

学生姓名：余永浩

指导教师：_钱晓莉___

实验日期:__2013.4.15-2013.4.19_____

一、实验名称

总大肠菌群的检验

二、实验目的

（1）了解总大肠菌群的数量指标在环境领域的重要性，学会总大肠菌群的检验方法。

（2）通过检验过程，了解大肠菌群的生化特性。

三、实验原理

人的肠道中主要有3大类细菌：①大肠菌群（G-菌）;②肠球菌（G+菌）;③产气荚膜杆菌（G+菌）。由于大肠菌群的数量最大，在体外存活时间和肠道致病菌相近，且检验方法比较简单，所以被定为检验肠道致病菌的指示菌。

总大肠菌群包括肠杆菌科中的埃希氏菌属（模式种：大肠埃希氏菌）、柠檬酸细菌属、克雷氏菌属及肠杆菌属。这4种菌属都是兼性厌氧、无芽孢的革兰氏阴性杆菌（G-菌），他们的生化反应特点已在微生物的生理章节中介绍。

大肠菌群的检测方法主要有多管发酵和滤膜法。前者被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种到乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查处大肠菌群的近似值。后者是一种快速的替代方法，能测定大体积的水样，但至局限于饮用水或较为干净的水，目前在一些大城市的水厂采用此法。

四、实验仪器及其材料

（一）器皿

显微镜、锥形瓶（500ml）1个、试管（18mm×180mm）6或7支、、大试管（容积150ml）2支、移液管1ml2支及10ml一支、培养皿10套、、接种环、试管架一个

（二）试剂、材料

（1）化学药品：蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、质量浓度16g/L的溴甲酚紫乙醇容溶

液、质量浓度50g/L的碱性品红溶液、质量浓度20g/L的伊

红水溶液、质量浓度5g/L的亚甲蓝水溶液

（2）采集于贵大新校区的生活污水

（3）革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、体积分数为95%的乙醇、番红染液。

（4）其他：100g/L的氢氧化钠、体积分数10%的HCl、pH试纸五、实验步骤：

（一）配制培养基：（4月15日）

1.乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵的复发酵使用）

配方：蛋白胨10克、牛肉膏3克、乳糖5克、氯化钠5克、溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL、蒸馏水1000 mL

制备：将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2—7.4，再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，每管10mL，68.95kPa (115℃，10lb）高压灭菌

20min，取出后置于阴冷出备用。

2.三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵的初复发酵使用）

按照乳糖蛋白胨培养基的配方和制法，除蒸馏水外，其他成分量浓缩三倍。

3. 品红亚硫酸钠培养基（即远藤氏培养基）

该培养基供多管发酵的平板画线使用。

（1）配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、无水硫酸钠5g、50g/L的品红乙醇溶液20mL。

（2）制备：先将琼脂加入900mL蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，补足失水到1000mL，调

整pH为7.2-7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，

混匀后定量分装于锥形瓶中，包装后灭菌。

4. 伊红-亚甲蓝培养基

（1）配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20g—30g、蒸馏水l000ml、伊红水溶液（20g/L) 20mL、亚甲蓝水溶液（5g/L）13mL。

（2）制备：与品红亚硫酸钠的制备过程相同，琼脂加入900mL蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀，补足

失水到1000mL调整pH为7.2-7.4趁热用脱脂棉过滤，再加

入乳糖，混匀后装于锥形瓶中，灭菌。

（二）测定步骤：（4月17日）

多管发酵法

（1）按要求配制乳糖蛋白胨培养基、三陪浓缩乳糖蛋白胨培养基、品红亚硫酸钠培养基、伊红-亚甲蓝培养基。

（2）初发酵试验：在2支各装有50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大发酵管中，以无菌操作各加入水样100mL。在10支各装有5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，以无菌操作各加入10mL水样，混匀后置于37℃恒温箱中培养24h，观察其产酸产气的情况。（3）确定性试验：用平板划线分离，将经培养24h后产酸的发酵管取出，无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于品红亚硫酸钠培养基平板上划线分离，置于37℃恒温箱内培养18~24h，观察菌落特征。（4）复发酵实验：

无菌操作，用接种环挑取具有培养基平板上菌落的特征的菌落于装有10mL普通浓度的发酵培养基内，每管可接种同一平板上的1~3个典型菌落的细菌，于37℃恒温箱内培养24h。观察。

六、实验结果及其分析讨论：

（1）在品红亚硫酸钠培养基平板上的菌落特征：

a:紫红色，具有金属光泽的菌落；

b：深红色，不带或者略带金属光泽的菌落；

c：淡红色，中心色较深的菌落。

（2）在伊红—亚甲蓝培养基平板上的菌落特征：

a：深紫黑色，具有金属光泽的菌落;

b：紫黑色，不带或者略带金属光泽的菌落；

c：淡紫黑色，中心色较深的菌落。

（3）复发酵实验：

根据本次实验得到的结果的可以发现的，新校区的污水的细菌总数远大于国家标准（书上附录六表-1）。