酵母蔗糖酶的提取及其性质研究
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纤维素—O—CH2—COO-—Na+
载体 电荷基团 反离子
蛋白质的电荷性质
NH
+ 3
Pr
COOH
O HH+
阳离子 pH<pI
NH
+ 3
Pr COO-
兼性离子
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pH=pI
O HH+
NH 2 Pr COO-
阴离子
pH>pI
在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴 离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离 子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂 的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋 白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵 母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶， 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。 在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组 成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们 的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)， 内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其 底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶 与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的 主要是外酶。
不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更 活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是 我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制 流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。
离子交换柱层析纯化蔗糖酶
操作步骤 1.离子交换剂的处理： DEAE- Sepharose Fast Flow离子交换剂保存在20%乙醇 中，使用前去除乙醇后，用去离子水洗涤3～5次。DEAESepharose Fast Flow 层析柱柱料昂贵，用后务必回收，重复操作 时，按“1mol/L NaCl 去离子水”的顺序洗即可。如果交换 剂过度污染，再生时用0.5 mol/L NaOH浸泡30 min，用蒸馏水洗 到中性，再用1mol/L NaCl 浸泡30 min，用蒸馏水洗到中性。最 后保存在20%的酒精溶液中。
层析法的分类
流动相有两种状态：
*液体作为流动相
*气体作为流动相
固定相也有两种状态：
*固体吸附剂作为固定相
*以吸附在固体上的液体作为固定相
按两相所处的状态分类：
液相层析 液-固层析
液-液层析
气相层析 气-固层析
气-液层析
按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的
酵母蔗糖酶的提取及其性质研究
1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。
2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层 析技术。
本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学 习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性 质，尤其是动力学性质作初步的研究。
实验原理
自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。 蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶） （EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解， 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催 化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
阴离子交换剂分离蛋白质的过程
Cl-ClC- l- ClCl-
ClC- lC- lClC- l-ClC- l-Cl-
+
Cl-
Cl-
Cl-
ClCl-
ClCl-
平衡
吸附 去吸附 分离结束 再生
低
高
盐
盐
利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來
离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先 要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙 增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除 杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗 至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进 一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子 交换剂中通常阳离子交换剂为Na型（即平衡离子是Na离子），阴 离子交换剂为Cl型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交 换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl， 碱是NaOH或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为Na 型，阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L，浸泡时间一般30 min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处 理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要 注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以 纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
Column Chromatography
离子交换层析
利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷 不同，因而与离子交换树脂有不同的吸附力 而分离
改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小 的蛋白质先洗脱下来。
离子交换层析(sephorase DEAE fast flow)
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚 糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白 质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳 离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙 基（Dicthylaminoethyl，DEAE）。在纤维素上结合了 DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6H14NH+，它的 反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行 交换。
（1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥 地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离 心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，8000rpm， 离心10min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出0.5ml测定酶活力 及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入
少量食盐），逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时 轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。 于4℃，10000rpm，离心10min，量出体积，留出0.5ml （下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖 子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。
两种酶的性质对照表如下：
名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度
外酶 27万 50% 双 26mM
150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃
内酶13.5万 ＜3% 双 25mM
150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃
实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗 糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量 定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位 数。
层析
层析法的基本原理
利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附 力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）， 使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并 以不同的速度移动而达到分离的目的。
mobile phase：携带样品流过整个系统的流体 stationary phase：静止不动的一相
差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的
分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力
的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分
阻滞作用的不同。
吸附层析
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方 向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流 动相展开，以达到分离鉴定的目的。
当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂， 如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带 有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO-），其反离子为 阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
离子交换剂：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
如羧甲基纤维素离子交换剂组成
操作步骤
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及少量二氧化硅， 放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的去离子水6ml（分两次）缓慢加入酵母中， 边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的 效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的10ml去离子水，每次加2ml左右，边 加边研磨，至少用10分钟。 （5）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机 离心，4℃，8000rpm，10min。如果中间白色的脂肪层厚，说
交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl） 都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中， 则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被 吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附， 吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用 两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强 度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳 离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑 制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。 当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳 离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。
本实验共有三个分实验：
一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化
细胞破壁的几种方法
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒 盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上 下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用 于量少和动物脏器组织。 3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细 胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破 裂，此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠 （SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处 理效果更好。 6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低 溶质的溶解度使其沉淀被析出。
明研磨效果良好。
（6）用滴管小心地取出上清，转入另一个清洁的离心管中， 4℃，8000rpm，离心10min。
（7）将上清液转入量筒，量出体积，留出0.5ml测定酶活力 及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0， 称为“粗级分I”。
2. 热处理
2.装柱与平衡：
先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用 此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近 时即可上样。（一般洗2-3个柱体积）
3.上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml 0.02M
层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测 仪、部分收集器、梯度洗脱器。
层析设备
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
低 温 层 析 柜
柱上操作
⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用碱式滴定管代替。处理 过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管 中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。 ⑵上样向层析柱内倾入样品液 ⑶洗涤杂蛋白 (4)洗脱与收集
载体 电荷基团 反离子
蛋白质的电荷性质
NH
+ 3
Pr
COOH
O HH+
阳离子 pH<pI
NH
+ 3
Pr COO-
兼性离子
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pH=pI
O HH+
NH 2 Pr COO-
阴离子
pH>pI
在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴 离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离 子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂 的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋 白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵 母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶， 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。 在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组 成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们 的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)， 内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其 底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶 与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的 主要是外酶。
不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更 活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是 我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制 流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。
离子交换柱层析纯化蔗糖酶
操作步骤 1.离子交换剂的处理： DEAE- Sepharose Fast Flow离子交换剂保存在20%乙醇 中，使用前去除乙醇后，用去离子水洗涤3～5次。DEAESepharose Fast Flow 层析柱柱料昂贵，用后务必回收，重复操作 时，按“1mol/L NaCl 去离子水”的顺序洗即可。如果交换 剂过度污染，再生时用0.5 mol/L NaOH浸泡30 min，用蒸馏水洗 到中性，再用1mol/L NaCl 浸泡30 min，用蒸馏水洗到中性。最 后保存在20%的酒精溶液中。
层析法的分类
流动相有两种状态：
*液体作为流动相
*气体作为流动相
固定相也有两种状态：
*固体吸附剂作为固定相
*以吸附在固体上的液体作为固定相
按两相所处的状态分类：
液相层析 液-固层析
液-液层析
气相层析 气-固层析
气-液层析
按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的
酵母蔗糖酶的提取及其性质研究
1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。
2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层 析技术。
本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学 习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性 质，尤其是动力学性质作初步的研究。
实验原理
自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。 蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶） （EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解， 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催 化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
阴离子交换剂分离蛋白质的过程
Cl-ClC- l- ClCl-
ClC- lC- lClC- l-ClC- l-Cl-
+
Cl-
Cl-
Cl-
ClCl-
ClCl-
平衡
吸附 去吸附 分离结束 再生
低
高
盐
盐
利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來
离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先 要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙 增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除 杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗 至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进 一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子 交换剂中通常阳离子交换剂为Na型（即平衡离子是Na离子），阴 离子交换剂为Cl型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交 换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl， 碱是NaOH或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为Na 型，阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L，浸泡时间一般30 min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处 理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要 注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以 纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
Column Chromatography
离子交换层析
利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷 不同，因而与离子交换树脂有不同的吸附力 而分离
改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小 的蛋白质先洗脱下来。
离子交换层析(sephorase DEAE fast flow)
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚 糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白 质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳 离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙 基（Dicthylaminoethyl，DEAE）。在纤维素上结合了 DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6H14NH+，它的 反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行 交换。
（1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥 地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离 心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，8000rpm， 离心10min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出0.5ml测定酶活力 及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入
少量食盐），逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时 轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。 于4℃，10000rpm，离心10min，量出体积，留出0.5ml （下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖 子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。
两种酶的性质对照表如下：
名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度
外酶 27万 50% 双 26mM
150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃
内酶13.5万 ＜3% 双 25mM
150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃
实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗 糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量 定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位 数。
层析
层析法的基本原理
利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附 力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）， 使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并 以不同的速度移动而达到分离的目的。
mobile phase：携带样品流过整个系统的流体 stationary phase：静止不动的一相
差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的
分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力
的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分
阻滞作用的不同。
吸附层析
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方 向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流 动相展开，以达到分离鉴定的目的。
当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂， 如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带 有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO-），其反离子为 阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
离子交换剂：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
如羧甲基纤维素离子交换剂组成
操作步骤
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及少量二氧化硅， 放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的去离子水6ml（分两次）缓慢加入酵母中， 边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的 效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的10ml去离子水，每次加2ml左右，边 加边研磨，至少用10分钟。 （5）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机 离心，4℃，8000rpm，10min。如果中间白色的脂肪层厚，说
交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl） 都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中， 则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被 吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附， 吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用 两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强 度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳 离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑 制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。 当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳 离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。
本实验共有三个分实验：
一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化
细胞破壁的几种方法
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒 盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上 下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用 于量少和动物脏器组织。 3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细 胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破 裂，此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠 （SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处 理效果更好。 6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低 溶质的溶解度使其沉淀被析出。
明研磨效果良好。
（6）用滴管小心地取出上清，转入另一个清洁的离心管中， 4℃，8000rpm，离心10min。
（7）将上清液转入量筒，量出体积，留出0.5ml测定酶活力 及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0， 称为“粗级分I”。
2. 热处理
2.装柱与平衡：
先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗琼脂糖凝胶几次，装柱，然后用 此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近 时即可上样。（一般洗2-3个柱体积）
3.上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用30ml 0.02M
层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测 仪、部分收集器、梯度洗脱器。
层析设备
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
低 温 层 析 柜
柱上操作
⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用碱式滴定管代替。处理 过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管 中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。 ⑵上样向层析柱内倾入样品液 ⑶洗涤杂蛋白 (4)洗脱与收集