构建质粒

构建质粒
一、选择载体
选择合适的载体，可在SnapGene Viewer上查看载体图谱，选择合适的酶切位点。

二、设计引物
根据目的基因的序列和酶切位点设计目的基因全长引物。

三、提取RNA
提取步骤见试剂盒说明书或见RNA提取篇
四、逆转录
逆转录步骤见试剂盒说明书
五、PCR扩增
这一步要使用高保真酶，按照说明书的条件进行PCR扩增，扩增完成后进行琼脂糖电泳。

六、琼脂糖电泳
1.5%琼脂糖（含万分之一Goldview核酸染料）将扩增产物进行电
泳，电泳缓冲液1*TAE,电压120V，电泳45分钟，电泳后用凝胶成像系统观察是否有目的基因条带。

七、胶回收
胶回收步骤见试剂盒说明书
八、酶切
分别将胶回收的目的基因片段和空载质粒酶切，根据说明书进行酶切，37度酶切5小时。

九、电泳并胶回收
酶切后的目的基因和载体产物分别电泳并胶回收。

十、酶连
用T4连接酶按照说明书进行酶连，4度过夜。

十一、转化
1、从-80℃冰箱中取出100微升感受态，立即放冰上解冻（约2
分钟）；
2、加入2-3微升酶连产物，慢慢摇匀，并上放置30分钟；
3、42℃水浴热击60秒，速置冰上冷切3-5分钟；
4、向管中加入1mlLB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振
荡培养45分钟；
5、取上述菌液涂布于含抗生素的平板固体培养基上，正面朝上放
置30分钟（视实际情况而定），待菌液完全被吸收后倒置平板，37℃恒温培养箱培养12-16小时。

十二、挑菌、摇菌
将平板从37℃恒温培养箱中取出，在酒精灯旁边挑选单个肉眼可见的菌落，菌落不宜太大，否则会有杂菌混入。

将菌落挑入装有LB培养基的摇菌管中，放入恒温摇床中180-200rpm培养过夜（一般12-16小时）。

十三、抽提重组质粒
1、抽提前要甘油保菌（40%甘油和菌液1:1混匀，直接放置到-80℃
冰箱。

）
2、抽提步骤见试剂盒说明书
十四、重组质粒初步鉴定
1、将重组质粒进行酶切，37℃酶切1小时。

2、琼脂糖跑胶鉴定：将酶切产物置于1.5%琼脂糖（含万分之一
Goldview核酸染料）将扩增产物进行电泳，电泳缓冲液1*TAE,电压120V，电泳45分钟，电泳后用凝胶成像系统观察是否有目的基因条带。

十五、重组质粒测序
将重组质粒送公司进行测序，测序后BLAST比对结果，观察是否存在突变等情况。