生物发光检测法

ATP生物发光技术历史发展
ATP 生物发光法检测ATP 含量最初在1949 年被阐述。 ATP生物发光技术产生于20世纪70年代 1963 年McElroy最先引入荧光素酶-ATP 检测法，发现反应的结果是把化学能转化 为光能。
ATP生物发光技术历史发展
1983 年，Moyer等最早提出细胞内源性 ATP 含量可以反映细胞的活性和活细胞的 数量。同年Gronroos等也证实该技术是一 种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检 测方法。 20 世纪80 年代，英国人首先研制出ATP 检测仪，并逐步发展到欧洲、美国和日本。 20世纪末，ATP 检测仪及技术被引进我国。
移取100 μL 样品提取液加入微孔板, 再加 入100 μL 虫萤光素-萤光素酶底物溶液, 微 孔板振荡器上混匀1 min后立即室温检测得 出发光值。
计算出ATP的浓度和活菌数量
对照由标准ATP试剂测量所得发光值和 ATP的浓度标准曲线，根据发光值得到 ATP的浓度，最后转化为微生物的浓度。
与传统方法的比较
样品ATP提取方法的优化
三种ATP提取方法比较 实验了3 种提取食品 中细菌ATP 的方法。 分别为双蒸水、磷酸 盐缓冲溶液加热提取 和三氯乙酸( 0. 03% TCA) 室温化学裂解 方法。3 种方法提取 结果见右图
a- 双蒸水体系煮沸; b- 磷酸盐缓冲体系 煮沸; c- 三氯乙酸裂解
测定样品生物发光值
pH对发光反应的影响 温度对发光反应的影响
BSA浓度对发光反应的影响
ATP生物发光反应标准曲线
样品ATP的提取
用生理盐水稀释酸奶和经过搅拌机绞碎的 火腿及蛋糕样品。三磷酸腺苷双磷酸酶用 于清除样品中所含游离ATP。 将前处理好的样品与pH 7.4 的缓冲溶液等 体积混合, 沸水浴中加热3 min 提取ATP, 12000 r/min 离心1 min，取上层清液待测。
ATP生物发光法原理
D-荧光素+ATP+O2
总思路：荧光
荧光素酶 Mg2+
Oxy-荧光素+AMP+PPi+H2O+荧光
微生物数量
ATP
第一步：荧光
ATP
其他底物过量，荧光强度与ATP含量成正比。 第二步：ATP 微生物数量
ATP仅存在于活的生物体中，且每个细胞的ATP含量大致相 同，因此可通过ATP的含量确定活的微生物的含量。
ATP生物发光法检测步骤
取样 样品ATP的提取 添加荧光素-荧光素酶 测定生物发光值 计算出ATP的浓度和活菌数量
关Hale Waihona Puke Baidu点
ATP的提取 游离的ATP的去除 提取剂的选择 提取条件的优化 反应条件的优化 D-荧光素浓度、萤火虫荧光素酶浓度、反 应pH、温度
便携式荧光光度仪
荧光分光光度仪
ATP生物发光技术举例
反应影响因素考察以及标曲图绘制
影响因素 pH、温度、BSA浓度 标准曲线的绘制 移取100 μL ATP 标准溶液加入微孔板, 再 加入100 μL 虫萤光素-萤光素酶底物溶液, 微孔板振荡器上混匀1 min后立即室温检测。 以ATP 浓度和发光强度分别取对数进行线 性拟和。
反应影响因素考察以及标曲图绘制
其他领域的应用
医学领域 药物敏感性试验，新药筛选和药物评价。 细胞学领域 细胞免疫活性检测。 环境工程领域 污染物浓度变化。
未来优化方向
可以尝试将ATP 生物发光法与DNA 分子识 别结合起来，可以鉴定菌种。 建立最优的游离ATP 去除体系。 找到最佳的微生物ATP 提取方法。 确立ATP 酶促反应的最佳条件。
实验目的：
探索提取以及反应的最佳条件 分别用ATP生物发光法和菌落计数法测定 五种样品（青岛啤酒、三鹿君乐宝酸奶、 三鹿君乐宝高该酸奶、双汇王中王火腿和 康师傅妙芙欧式蛋糕）中的细菌含量，并 比较这两种方法的相关性。
实验主要仪器与试剂
仪器 搅拌机、离心机、微孔板、微孔振荡器、 微孔板发光分析仪 试剂 ATP、萤光素、萤光素酶、三磷酸腺苷双 磷酸酶、小牛血清白蛋白（BSA）、三氯 乙酸、缓冲溶液、双氧水
同时参照GBPT 4789. 2- 2003 ， 采用传统方法培养 样品中细菌, 进行 菌落计数，其结果 与ATP生物发光法 方法检出ATP浓度 相比较。
生物发光法检测结果与 传统方法培养结果相关比较
ATP生物发光技术优点
检测灵敏 操作简便 结果快速 准确率较高 测定范围广
ATP生物发光技术缺点
受游离ATP和体细胞的影响 无法鉴定细菌种属 试剂昂贵 酶促反应影响条件多 某些时候灵敏度不够
ATP生物发光法在食品领域的应用
食品快速筛选和检测（微生物的快速检测） 肉品新鲜度，乳制品中的乳酸菌，啤酒中 菌落总数，脱水蔬菜的细菌学测定，粉状 食品和调味食品的细菌学测定。 食品生产设备与环境 色素、致癌物 农药残留
ATP生物发光技术
食品加工与安全研1301 胡程
萤火虫
栉水母
发光海虫
腰鞭毛虫
发光蘑菇
初识生物发光
生物发光是指生物自身发光细胞构成发光 器而发光。生物发光属于化学发光的范畴， 化学能转化为光能的效率几乎为100%。 发光机制：细胞合成的化合物质，在特定 酶的作用下，使化学能转化为光能。 近年来，多种生物发光技术已经广泛应用 到科学的各个领域，其中ATP生物发光技 术是应用比较成熟的一种技术。
未来发展趋势
随着科学技术的飞速发展，相信ATP 生物 发光法会变得更加成熟，其相应的仪器设 备等也会越来越先进，满足食品、医疗、 环境等行业的实际需求，为我们人类造福。