细胞划痕课件
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细胞划痕实验
细胞划痕
一、基本原理 细胞划痕（Wound Healing ）法是简捷测定细胞迁移运 动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体 外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头 或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部 分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例 如24h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否迁移 （修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能 力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是 加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通 过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同， 可以判断各组细胞的迁移与修复能力
一、实验原理：细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动 特性方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模 型，在体外培养的单层细胞上划痕致伤，加入药 物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力
二、实验材料：1） 细胞系及其培养：肝肿瘤细 胞HepG2 2） 24孔板 移液器 倒置显微镜 3） 主要试剂：PBS DMEM培养液 0.25%胰 酶胎牛血清 5-氟尿嘧啶溶液（1ug/ml）
细胞划痕
三、实验步骤
1．制备单层细胞：细胞密度5~10×105 /mLHep G2细胞铺于24孔 板（每孔500 uL）上，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液培养 16~24 h,使形成单层细胞 2．划痕 ：以五氟尿嘧啶（5－Fu）为例，首先配制1 μg/μL母液 (使用无菌蒸馏水配制，精密量取），取45 μL该母液用PBS稀释至 1.1 mL，得浓度40 μg/mL5－Fu溶液 ，用10 uL移液枪枪头（或者 无菌牙签）在单层细胞上呈一字划痕，用PBS清洗3次，然后加入上 面配好5－Fu溶液，平行两个样本，孵育24 h，换成含10％胎牛血 清的DMEM培养液孵育24 h 3．观察并拍照：吸去培养液，用PBS清洗3次，倒置荧光显微镜下 观察并拍照
细胞划痕
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细胞划痕
细胞划痕
细胞划痕
四、注意事项： 1． 实验时应注意细胞生长状况，选择适当细胞 接种浓度，对不同细胞要观察细胞贴 壁率等，确 定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养 终止时密度适当。 2． 用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，免 冲散单层贴壁细胞影响实验拍照结果。 3． 药物筛选过程，其对细胞迁移能力影响也是重 要的一方面，实验设计过程需 要选择适当阳性对 照组和阴性对照组。
细胞划痕
划痕结果图
细胞划痕
0h
6h
小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3
12h 细胞划痕24h
细胞划痕
• 四、注意事项： • 1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，
以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。 • 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清
（<2%）否则细胞增殖就不能忽略。（也可用丝裂 霉素处理一小时） • 3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成 若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后 观察时位置不固定的问题。
细胞划痕
culture Insert 方法（保证划痕的均一度） 1. 准备细胞，培养液。 2. 如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert 区域后用镊子移 除Insert即可产生500 μm宽度的划痕。 3. 每隔4-6小时拍照记录。 4. 根据收集图片数据分析实验结果。
细 胞 定 位 格 子 培 养 皿
细胞划痕
二、实验步骤 准备Biblioteka Baidu所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker 笔在操作前紫外照射30min（超净台内）
1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀 得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每 孔至少穿过5条线。 2.在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞不 同而不同，掌握为过夜能铺满。 3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线 划痕，枪头要垂直，不能倾斜，不同孔之间最好使 用同一枪头。 4.用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加入无血清 或低血清培养基。 5.放入37度5% CO2培养箱，培养。按0，6，12， 24小时取样，拍照。
细胞划痕
细胞划痕
三、实验结果 统计方法：使用Image J软件打开图片后，随机划取6至
8条水平线，计算细胞间距离的均值，测量划痕区域的像素 定量比较细胞迁移的速度。 其他结果分析工具：Wound Healing Image Analysis – WimScratch
Image Pro Plus
细胞划痕
细胞划痕
特点： 1. 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2. 价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围 环境简单单纯，容易控制。 3. 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析 细胞间的相互作用。 4. 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。
细胞划痕
举例：抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）
细胞划痕
一、基本原理 细胞划痕（Wound Healing ）法是简捷测定细胞迁移运 动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体 外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头 或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部 分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例 如24h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否迁移 （修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能 力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是 加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通 过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同， 可以判断各组细胞的迁移与修复能力
一、实验原理：细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动 特性方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模 型，在体外培养的单层细胞上划痕致伤，加入药 物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力
二、实验材料：1） 细胞系及其培养：肝肿瘤细 胞HepG2 2） 24孔板 移液器 倒置显微镜 3） 主要试剂：PBS DMEM培养液 0.25%胰 酶胎牛血清 5-氟尿嘧啶溶液（1ug/ml）
细胞划痕
三、实验步骤
1．制备单层细胞：细胞密度5~10×105 /mLHep G2细胞铺于24孔 板（每孔500 uL）上，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液培养 16~24 h,使形成单层细胞 2．划痕 ：以五氟尿嘧啶（5－Fu）为例，首先配制1 μg/μL母液 (使用无菌蒸馏水配制，精密量取），取45 μL该母液用PBS稀释至 1.1 mL，得浓度40 μg/mL5－Fu溶液 ，用10 uL移液枪枪头（或者 无菌牙签）在单层细胞上呈一字划痕，用PBS清洗3次，然后加入上 面配好5－Fu溶液，平行两个样本，孵育24 h，换成含10％胎牛血 清的DMEM培养液孵育24 h 3．观察并拍照：吸去培养液，用PBS清洗3次，倒置荧光显微镜下 观察并拍照
细胞划痕
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细胞划痕
细胞划痕
细胞划痕
四、注意事项： 1． 实验时应注意细胞生长状况，选择适当细胞 接种浓度，对不同细胞要观察细胞贴 壁率等，确 定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养 终止时密度适当。 2． 用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，免 冲散单层贴壁细胞影响实验拍照结果。 3． 药物筛选过程，其对细胞迁移能力影响也是重 要的一方面，实验设计过程需 要选择适当阳性对 照组和阴性对照组。
细胞划痕
划痕结果图
细胞划痕
0h
6h
小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3
12h 细胞划痕24h
细胞划痕
• 四、注意事项： • 1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，
以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。 • 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清
（<2%）否则细胞增殖就不能忽略。（也可用丝裂 霉素处理一小时） • 3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成 若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后 观察时位置不固定的问题。
细胞划痕
culture Insert 方法（保证划痕的均一度） 1. 准备细胞，培养液。 2. 如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert 区域后用镊子移 除Insert即可产生500 μm宽度的划痕。 3. 每隔4-6小时拍照记录。 4. 根据收集图片数据分析实验结果。
细 胞 定 位 格 子 培 养 皿
细胞划痕
二、实验步骤 准备Biblioteka Baidu所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker 笔在操作前紫外照射30min（超净台内）
1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀 得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每 孔至少穿过5条线。 2.在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞不 同而不同，掌握为过夜能铺满。 3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线 划痕，枪头要垂直，不能倾斜，不同孔之间最好使 用同一枪头。 4.用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加入无血清 或低血清培养基。 5.放入37度5% CO2培养箱，培养。按0，6，12， 24小时取样，拍照。
细胞划痕
细胞划痕
三、实验结果 统计方法：使用Image J软件打开图片后，随机划取6至
8条水平线，计算细胞间距离的均值，测量划痕区域的像素 定量比较细胞迁移的速度。 其他结果分析工具：Wound Healing Image Analysis – WimScratch
Image Pro Plus
细胞划痕
细胞划痕
特点： 1. 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2. 价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围 环境简单单纯，容易控制。 3. 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析 细胞间的相互作用。 4. 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。
细胞划痕
举例：抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）