第六章第一节致病性大肠埃希氏菌及其检验

C-枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验
• 利用枸橼酸盐生长 +
• 不能利用
-
•
一、埃希氏菌属生物学特性
抵抗力 • 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60
分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。 • • 在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低
的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素 等敏感，青霉素对它的作用弱, 易产生耐药菌株.
• 原理：伊红美蓝琼脂平板含伊红和美蓝染料，在 此亦作为指示剂。大肠菌群发酵乳糖造成酸性环 境时，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美兰 结合（该两种染料即结合成复合物）使大肠菌群 产生带核心的、有金属光泽的深紫色的（龙胆紫 的紫色）阳性菌落，从菌落表面的反射光中还可 看到绿色金属闪光。在伊红美兰平板上的典型菌 落呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润， 常有金属光泽。有的由于被检样品影响，亦呈现 紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为 大肠杆菌，均应注意挑选。
2）H抗原 为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原， 无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能 被酒精破坏。H抗原共有64种。
• 3）K抗原
• 是细胞外部的荚膜或菌体表面物质，又称包膜抗原。新 分离的大肠埃希氏菌70％具有K抗原。根据K抗原耐热的 敏感性．可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致 病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原， B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强， 可耐受煮沸1小时而不被破坏。，
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（一）、增菌培养 1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养
肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均 质器打碎样品。 2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群 MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6小 时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌肉汤 中，42℃增菌培养18小时。
• 在麦康基培养基上培养的大肠埃希杆菌 大肠埃 希杆菌产生粉红色乳糖发酵菌落。麦康基培养基 是肠道细菌的选择培养基，含胆盐、乳糖和pH指 示剂中性红。乳糖发酵菌落产生酸，将指示剂变 红。（麦康基琼脂，18小时，37℃）
革兰氏阴性杆菌
革兰氏阳性杆菌
大肠杆菌扫描电镜照片
大肠杆菌透射电镜照片
大肠杆菌革兰氏染色照片
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板 上的特征
EMB培养基，上为E.coli，下为伤寒杆菌
大肠杆菌在麦康凯琼脂（ＭａｃＣ）的特征
• 麦康凯琼脂（ＭａｃＣ）或伊红美兰（ＥＭＢ）琼脂 平板上，置３７°培养１８—２４小时，检查有无疑 似大肠杆菌菌落。大肠杆菌在麦康凯平板上的典型菌 落呈鲜艳的桃红、粉红色.
大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板上的特征
大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板 上的特征
大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板粘稠 菌落的特征
沙门氏菌麦康凯琼脂平板菌落
不发酵乳糖
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（三）、生化试验
1、选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发 酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于三糖铁(TSI) 或克氏双糖铁琼脂(KI).同时将这些培养物分别接 种蛋白胨水、半固体、尿素琼脂、氰化钾肉汤和
• 大肠杆菌ＩＭＶｉＣ试验的模式反应，在一般情 况下应为“＋＋－－”或将“－＋－－”也包括 在内，共代表了绝大多数大肠杆菌（占９９％） 的实际反应结果，因而受ＶｉＣ反应 公式。但个别大肠杆菌的ＩＭＶｉＣ反应，也可 能出现“＋－－－”和“＋＋－＋”等等异常现 象。由于这种异常反应出现的频率极少，没有普 遍性的代表意义，因而在分类鉴别和统计学上， 可以忽略不计。
•
I-吲哚（indol）试验
色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚 ↑
吲哚试剂 •
M-甲基红（methyl red）实验 葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 葡萄糖→丙酮酸
甲基红 甲基红 +
V-VP（Voges-Proskauer）试验 葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→二乙酰→红色化合物+
胍基化合物 葡萄糖→丙酮酸 × × 乙酰甲基甲醇
致病性大肠埃希氏菌的检验
（四）血清学试验 • 假定试验：
从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病 性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒 素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌 O157血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做 阴性报告。当与某一种多价O血清凝集时,再与该 多价血清所包含的单价血清做实验,如与某一种单 价O血清呈现强烈的凝集反应,即为假定实验阳性. 不凝集的培养物可做阴性报告。
枸椽酸盐试验原理及斜面照片
• 枸椽酸盐试验： 某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸 铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养 基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变 为兰色。大肠杆菌阴性,产气杆菌阳性.
枸椽酸盐试验原理及斜面照片
大肠杆菌：MR + /VP -
• 注〕关于大肠杆菌的ＩＭＶｉＣ反应的说明
5）在鲜血琼脂平板上生长，有些菌株可见β溶血环。
6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落
7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌， 也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落；
8）在伊红美兰琼脂上形成紫黑色具有金属光泽的菌 落
9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色
•
埃希氏菌在S．S琼脂平板上形成红色菌落
LT与ST的比较
特性
不耐热肠毒素
分子量
较大，73000
耐热性
不耐热
免疫原性 有
B亚单位受体 肠黏膜GM1神经节苷酯
耐热肠毒素
较小，1500-5000
耐热 无 肠黏膜GM1神经节苷酯
致病机理
活化细胞腺苷酸环化酶，活化细胞鸟苷酸环化酶，
细胞内cAMP含量升高， 细胞内cGMP含量升高，
分泌功能亢进，引起腹 分泌功能亢进，引起腹
赖氨酸脱羧酶实验培养基。经36℃培养18-24小时。
弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养 物。
2、TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,氰化 钾阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌. TSI底层不产酸或 H2S、氰化钾、尿素有任何一项 为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做 氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。
• 血清学特性 大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)， 鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。
1）O抗原 成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也 是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理 2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原， 本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表 示。
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
（二）、分离培养 1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种
于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。 2、于36±1℃ 培养18—24小时观察菌落对于污染严重的食品可 直接按划线法接种，不经过增菌过程。不但要注 意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵的 菌落。
EMB平板照片及原理
• O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原 和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希 氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111： K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般 不需要进行H抗原的鉴定。
二、致病性大肠埃希氏菌的检验
• 致病性大肠埃希氏菌的检验应按《中华人民共和 国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部 分)》(GB489．6-84)的有关内容进行检验。其检 验程序如图5－2。
• 5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)
• 致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热{ST) 和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食 物中毒。引起大肠埃希氏菌中毒的主要是一些动 物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛 和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。
•
• 1996年7月在日本就发生了大肠杆菌0157 型引起的食物中毒，造成9017多人中毒， 10人死亡，其原因与生食萝卜苗有关，其 中92例并发出血性肠炎及出血性尿毒症。 2001年，再江苏、安徽等地爆发的肠出血 性大肠杆菌0157:H7食物中毒，造成177人 死亡，中毒人数超过2万人。
致病性大肠埃希氏菌及其检验
大肠埃希氏菌,俗称大肠杆菌,是人 类和动物肠道中正常菌群的主要 成员,每克粪便中约含109个.大肠 埃希氏菌随粪便排出后,广泛分布 于自然界.水、牛乳及其他食品一 旦检出大肠埃希氏菌，即意味着 这些物品直接或间接被粪便污染。
• 正常情况下，大肠埃希氏菌不致病，而且还能合 成维生素B和维生素K,生产大肠菌素，对机体有利。 但当机体抵抗力下降或大肠埃希氏菌侵入肠外组 织或器官时，可作为条件致病菌而引起肠道外感 染。有些血清型可引起肠道感染。致病性大肠埃 希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分 为三大类， 1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)， 2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC) 3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC) 近来又提出另外两类 4、出血性大肠埃希氏菌(EHEC)
一、埃希氏菌属生物学特性
致病性：（1）致病因素
• 侵袭力:大肠杆菌具有抗原和菌毛,抗原有抗吞噬 作用,有抵抗抗体和补体的作用,菌毛能帮助细菌 黏附于黏膜表面.有侵袭力的菌株可以侵犯肠道表 皮层引起炎症.
• 内毒素:大肠杆菌细胞壁具有内毒素的活性
• 肠毒素:有两种,不耐热肠毒素(LT),成分可能是蛋 白质,加热65℃经30min即被破坏. LT与霍乱菌肠 毒素作用相似,都是刺激小肠上皮细胞的腺苷环化 酶,使ATP转变为CAMP,促进肠黏膜细胞的分泌功能, 使肠液大量分泌,引起腹泻;耐热肠毒素(ST)无免 疫性,耐热,100℃经10-20min不被破坏,也可使肠 道细胞的CAMP水平升高,引起腹泻.
• 如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻和败 血症等均可由大肠杆菌引起。