感染性疾病的分子诊断课件
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基因病的分子诊断
Molecular diagnosis for genic diseases
1
基因病概念
1975年，Dulbecco 提出：人类的DNA序列 是人类的真谛，包括癌症在内的人类疾病的 发生都与基因直接或间接有关
1978年，Susumu Tinegawa：从人类所有的 疾病都与基因受损有关的角度出发，提出了 人类疾病新概念——基因病（genic disease）
6
支链DNA技术（branched DNA, bDNA）
bDNA技术为一种核酸探针杂交标记信号放大技术 特点：
不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素 少，因此稳定性、重复性高，结果准确。
操作简便：只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性 为单链，即可进行检测，不需事先纯化
缺点：
就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适用于低水 平检测。
第一代bDNA技术的检测范围3.5×105~5.7×107copies/ml 第二代bDNA技术的敏感性有所提高，可2×105copies/ml
7
基因病的分子诊断技术
基于蛋白质的分子诊断技术
ELISA（酶联免疫吸附分析）
Chip Western blot
传感器
5
基因病的分子诊断技术
基于核酸的分子诊断技术
bDNA
PCR
PCR类型：巢式PCR，等温PCR，…… 定性PCR
PCR产物 ＋ RE酶切 → 电泳 PCR产物 ＋ RE酶切 → 杂交 定量PCR FQ-PCR（real-time PCR）
印迹：Southern/Northern blot Chip：micro-array 测序技术（sequencing）
完整性策略：
检出病原体 分型（分类）－亚型－耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
13
感染性疾病分子诊断标志物
病原体核酸分子（DNA/RNA）
基因表达产物
代谢物
免疫应答分子 细
致敏T细胞
胞Байду номын сангаас免
T
T
疫
淋巴因子
体
IgM 感染早期出现
液 免
B
浆细胞
IgG 临近恢复期出现 IgA
）
世界其它地区
亚太地区 75%
全世界有3.5亿慢性携带者， 75%在亚太地区
每年有一百万人死于HBV感染 ，是全球范围内第9位死因
中国：50%~70%的人受过感染
，8%~10%是HBV携带者
75%的长期慢性携带者 来自亚太地区
19
第一节 病毒的基因检测
HBV的形态特征 HBV外膜携带的HBsAg抗原性有一个 属特异性的抗原决定簇“a”和至少两个 亚型决定簇“d/y”和“w/r”（尚有少见 的q、g、n、x和t等亚型决定簇） 最常见的血清型为adw、adr和ayw 亚型的地区分布不同，我国以adr为主， adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内 蒙古等地
10
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
11
感染后果（转归）
病原体被清除 ------ 通过非特异性或特异性免疫 隐性感染 ------ 是感染过程中最常见的类型 显性感染（临床感染） ------ 感染致病，慢性感染引起炎症 潜伏性感染
2
基因病
单 基 因 病（monogenic diseases）
孟德尔遗传性疾病，诸如：白化病、早老症、 血红蛋白病、甲型血友病、囊性纤维化病、脆 性X综合征等
获 得 性 基 因 病（acquired genetic disease）
感染性疾病，诸如：HBV、HCV、HIV、HPV等
多 基 因 病（polygentic diseases）
潜伏感染期间，病原体一般不排出体外 病原携带状态 ------ 可以没有临床症状，而能排出病原体
带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者 不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性
携带者 是很多传染病的重要传染源
12
感染性疾病的分子诊断策略
一般性策略（检出病原体）：
判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR ＋ 杂交
包膜（envelope） 刺突（spike）
核酸（nucleic acid）
DNA or RNA
衣壳（capsid）
衣壳粒
蛋白质衣壳 核酸
17
第一节 病毒的基因检测
检测病毒的方法
血清学检测 病毒分离鉴定（诊断的金标准） PCR技术（检出率最高）
18
第一节 病毒的基因检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV
复杂性（多因素）疾病，诸如：肿瘤、心脑血管 疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病 等等
3
中国：引起死亡的主要疾病
89.1%
91.6%
4
基因病的分子诊断
诊断分子（标志物） 诊断技术
核酸
分子杂交
蛋白质 多糖类
代谢物（生物小 分子）
激素 代谢产物
PCR 测序 芯片 光谱 色谱 质谱 核磁共振
疫
IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
14
感染性疾病的分子诊断临床价值
定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病 毒、细菌和寄生虫感染的诊断
动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判 断和病情预后评价提供客观的依据
15
第一节 病毒的基因检测
16
病毒
第一节 病毒的基因检测
核衣壳 （nucleocapsid）
UPLC HPLC
2D 电泳
质谱 分离 飞行时间质谱（TOF）
LC-Mass，GC-Mass
核磁共振（NMR） 质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比
8
基因病的分子诊断技术
基于代谢组学的分子诊断技术
质谱 核磁共振 光谱 色谱
9
第十章 感染性疾病的分子诊断
Molecular diagnosis for infectious diseases
DNA 病毒 双链（非环状） DNA不等长
正链（2/3） 负链
20
第一节 病毒的基因检测
HBV在肝细胞内的复制
传染性HBV 病毒颗粒
传染性HBV 病毒颗粒
DNA 部分双链 聚合酶
DNA
负链DNA
逆转录酶
cccDNA
A(n) mRNA
Molecular diagnosis for genic diseases
1
基因病概念
1975年，Dulbecco 提出：人类的DNA序列 是人类的真谛，包括癌症在内的人类疾病的 发生都与基因直接或间接有关
1978年，Susumu Tinegawa：从人类所有的 疾病都与基因受损有关的角度出发，提出了 人类疾病新概念——基因病（genic disease）
6
支链DNA技术（branched DNA, bDNA）
bDNA技术为一种核酸探针杂交标记信号放大技术 特点：
不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素 少，因此稳定性、重复性高，结果准确。
操作简便：只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性 为单链，即可进行检测，不需事先纯化
缺点：
就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适用于低水 平检测。
第一代bDNA技术的检测范围3.5×105~5.7×107copies/ml 第二代bDNA技术的敏感性有所提高，可2×105copies/ml
7
基因病的分子诊断技术
基于蛋白质的分子诊断技术
ELISA（酶联免疫吸附分析）
Chip Western blot
传感器
5
基因病的分子诊断技术
基于核酸的分子诊断技术
bDNA
PCR
PCR类型：巢式PCR，等温PCR，…… 定性PCR
PCR产物 ＋ RE酶切 → 电泳 PCR产物 ＋ RE酶切 → 杂交 定量PCR FQ-PCR（real-time PCR）
印迹：Southern/Northern blot Chip：micro-array 测序技术（sequencing）
完整性策略：
检出病原体 分型（分类）－亚型－耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
13
感染性疾病分子诊断标志物
病原体核酸分子（DNA/RNA）
基因表达产物
代谢物
免疫应答分子 细
致敏T细胞
胞Байду номын сангаас免
T
T
疫
淋巴因子
体
IgM 感染早期出现
液 免
B
浆细胞
IgG 临近恢复期出现 IgA
）
世界其它地区
亚太地区 75%
全世界有3.5亿慢性携带者， 75%在亚太地区
每年有一百万人死于HBV感染 ，是全球范围内第9位死因
中国：50%~70%的人受过感染
，8%~10%是HBV携带者
75%的长期慢性携带者 来自亚太地区
19
第一节 病毒的基因检测
HBV的形态特征 HBV外膜携带的HBsAg抗原性有一个 属特异性的抗原决定簇“a”和至少两个 亚型决定簇“d/y”和“w/r”（尚有少见 的q、g、n、x和t等亚型决定簇） 最常见的血清型为adw、adr和ayw 亚型的地区分布不同，我国以adr为主， adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内 蒙古等地
10
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
11
感染后果（转归）
病原体被清除 ------ 通过非特异性或特异性免疫 隐性感染 ------ 是感染过程中最常见的类型 显性感染（临床感染） ------ 感染致病，慢性感染引起炎症 潜伏性感染
2
基因病
单 基 因 病（monogenic diseases）
孟德尔遗传性疾病，诸如：白化病、早老症、 血红蛋白病、甲型血友病、囊性纤维化病、脆 性X综合征等
获 得 性 基 因 病（acquired genetic disease）
感染性疾病，诸如：HBV、HCV、HIV、HPV等
多 基 因 病（polygentic diseases）
潜伏感染期间，病原体一般不排出体外 病原携带状态 ------ 可以没有临床症状，而能排出病原体
带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者 不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性
携带者 是很多传染病的重要传染源
12
感染性疾病的分子诊断策略
一般性策略（检出病原体）：
判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR ＋ 杂交
包膜（envelope） 刺突（spike）
核酸（nucleic acid）
DNA or RNA
衣壳（capsid）
衣壳粒
蛋白质衣壳 核酸
17
第一节 病毒的基因检测
检测病毒的方法
血清学检测 病毒分离鉴定（诊断的金标准） PCR技术（检出率最高）
18
第一节 病毒的基因检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV
复杂性（多因素）疾病，诸如：肿瘤、心脑血管 疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病 等等
3
中国：引起死亡的主要疾病
89.1%
91.6%
4
基因病的分子诊断
诊断分子（标志物） 诊断技术
核酸
分子杂交
蛋白质 多糖类
代谢物（生物小 分子）
激素 代谢产物
PCR 测序 芯片 光谱 色谱 质谱 核磁共振
疫
IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
14
感染性疾病的分子诊断临床价值
定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病 毒、细菌和寄生虫感染的诊断
动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判 断和病情预后评价提供客观的依据
15
第一节 病毒的基因检测
16
病毒
第一节 病毒的基因检测
核衣壳 （nucleocapsid）
UPLC HPLC
2D 电泳
质谱 分离 飞行时间质谱（TOF）
LC-Mass，GC-Mass
核磁共振（NMR） 质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比
8
基因病的分子诊断技术
基于代谢组学的分子诊断技术
质谱 核磁共振 光谱 色谱
9
第十章 感染性疾病的分子诊断
Molecular diagnosis for infectious diseases
DNA 病毒 双链（非环状） DNA不等长
正链（2/3） 负链
20
第一节 病毒的基因检测
HBV在肝细胞内的复制
传染性HBV 病毒颗粒
传染性HBV 病毒颗粒
DNA 部分双链 聚合酶
DNA
负链DNA
逆转录酶
cccDNA
A(n) mRNA