固定化酶的制备方法及其在食品工业中的应用

固定化酶的制备方法及其在食品工业中的应用

酶参与体内各种代谢反应,而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂,酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应,一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应,而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来,酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。但在实际应用中,酶对环境敏感、反应后难以回收等缺点限制了酶制剂产品的开发和应用,在这种情况下,固定化酶应运而生。

酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

一、固定化酶的概念及其性质

固定化酶（immobilized enzyme）是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶,用人工方法固定在载体上。由于固定化酶的运动被化学或物理的方法限制了,能将其从反应介质中回收,所以它原则上能在批量操作或连续操作中重复使用酶。固定化酶技术是酶工程的核心,它使酶工程提高到一个新水平。

固定化酶具有如下性质:酶的稳定性提高;最适pH值改变;酶的活性和催化底物有所变化;最适温度有所提高。

二、固定化酶制备方法

固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。

载体结合法

最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。

此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。

交联法

依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

包埋法

酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化

酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。

新型固定化技术

运用当代高新技术设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。利用超声波使高

分子主链均裂产生自由引发功能性单体,再聚合成嵌段共聚物载体固定化酶的结果表明,借助现代技术可

使一般性聚合物经功能化改性成为新的酶固定化载体。

二、固定化酶技术在食品工业中的应用

固定化酶在食品添加剂和配料中的应用。固定化酶技术广泛应用于生产食品添加剂和配料的行业中。如:低聚果糖、天门冬氨酸、L-苹果酸、阿斯巴甜、酪蛋白磷酸肽(CPP)等

固定化酶在乳制品中的应用。牛奶是人们熟悉的营养佳品,其中含有5%的乳糖。由于部分人体内缺乏乳糖分解酶(即乳糖酶或半乳糖酶),饮用后会导致腹泻等症状,因此,无乳糖牛奶成为一种客观的需求。为了解决该问题,曾采用聚丙烯酰胺包埋法,将乳糖酶固定化后,于牛奶作用,去除乳糖。该研究在美国和日本极为盛行,在意大利,科学家从大肠杆菌的酵母中提取精制乳糖酶,用三乙酰纤维素膜包埋,生产无乳糖牛奶,该方法酶稳定性高,可以连续生产80天以上。此外,乳糖在温度较低时易结晶,用固定化乳糖酶处理后,可以防止其在冰淇淋类产品中结晶,改善产品口感,提高产品品质。

固定化酶在油酯工业中的应用。脂肪酶可以催化酯交换、酯转移、水解等反应,所以在油酯工业中有广泛应用。1, 3-特异性脂肪酶可酶促酯交换反应,将棕榈油改性为代可可酯。代可可酯是生产巧可力的原料,价格甚高,而棕榈油价廉,因此该工艺受到重视。Blooner[23]等用脂肪酶将棕榈油转化成代可可酯,Goto 等[24]用表面活性剂处理固定化酶,使酶活性大幅度提高,并延长固定化酶的寿命。

固定化酶在果汁中的应用。柑橘类产品加工中出现苦味是柑橘加工中的重要问题。造成苦味的物质有两类:一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物(A环和B环);另一类为果实中的黄酮苷。脱苦的方法主要有吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物质,而固定化酶法主要是利用不同酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷,生成不含苦味的物质。

固定化酶在茶叶加工中的应用。茶饮料质量的提高一方面是通过去除异味,提高适口性;另一方面是提高营养价值,提高人体对有益成分的吸收率。目前,固定化酶法已经开始应用于茶饮料中,并从上述两方面均取得了良好的效果。比如:固定化的单宁酶和果胶酶单宁酶是一种水解酶,可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键。将单宁酶应用于茶叶饮料可以改善茶饮料的品质。

此外，固定化酶技术在固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产、牛奶中的乳糖的水解、油脂改性、啤酒澄清以及食品检测等食品工业领域都得倒了充分的应用。

三、总结展望

综上所述，固定化酶在食品工业的各个方面都显示出广阔的应用前景。但是，并不是说一切都能够应用可溶性酶的地方都可以用固定化酶，也要权衡一下，使用后经济上是否合算。在实际应用中需要考虑各种因素，其中最重要的一些因素是：（1）用于固定化的载体和试验成本。（2）固定化后酶的活力和回收率。（3）操作过程中固定化酶的稳定性。（4）在长时间使用后，固定化酶的再生能力。

随着人类对环保的日益关注，酶的应用会更受关注。如何充分利用天然高分子载体，对其改性或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶，必将会成为研究的热点。同时，开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化率和生产能力，也是未来研究的重点。固定化酶在各行业的应用研究也必将推动酶固定化技术的发展。