多糖的结构分析

CH 2OH
H+ CHOH
+ O H2O HOHC CH 2OH
CH 2OH CH 2OH
以1→3位键合(1→3,6、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→2，3，4类似)
OH
H
O
H
IO-4
OH H
O
0
H OH
NaBH4
OH
H+ H
H
H2O
OH HO
H
OH
H OH
OH
第6章 多糖的结构分析
2、Smith降解：是将氧化产物还原后进行酸水解。
①喷试剂A，室温风干；②将纸浸入B液中，待斑点显色；③ 再浸入C中以洗去滤纸上的氧化银；④水冲洗1小时左右，风干， 显棕黑色斑点。
第6章 多糖的结构分析
2、乙酰解 冰醋酸溶液加入少许硫酸进行 乙酰解，可以生成乙酰化单糖通过气相色 谱鉴定。 原因：因为1-6糖苷键多糖对酸水解相对 稳定一些，但在乙酰解中则优先断裂，有 利于结构的研究。
第6章 多糖的结构分析
1→、1→6键型
H H
OH HO
H
OH
O H
2 IO4-
CH3 O
CHO
0 OH
+
OHC
HCOOH
CH2OH
NaBH4
O
O CH2OH
HOH2C
CH 2OH
+ H+ CHOH
O H2O CH 2OH
CH 2OH CH 2OH
以1→2位键合(1→2,6类似)
OH
H H
OH HO
第6章 多糖的结构分析
多糖（Polysaccharide）是天然大分子 物质，是天然化合物中最大族之一。多糖结 构的分析较蛋白质结构分析复杂，一方面是 因为组成多糖的单糖品种繁多（目前已知的 单糖有200多种）；另一方面即使只有一种单 糖组成的多糖其连接方式的不同以及可能有 分枝（蛋白质没有分枝），所以多糖的结构 种类就很多，不容易分析。
O CH3
H
O
H
O
CH3
O
H3C O
H
O CH3
O CH3 O
H O
O CH3
CH3
OH
H
O
CH3
CH3
H
O CH3
（水解、还原）
O CH3
O
3
H3C
H
O O
CH3
OH
+
H O CH3
O CH3
O
H
n
O CH3
OH
H3C
H
O
CH3
O CH3
H
+ 1 OH OH
OH OH
H
O CH3
(2,3,4,6-O-四甲基Glc)
H
O
H 0
OH
CH 2OH
CH2OH
IO-4
O
NaBH4
O
CHO OHC
O CH2OH
O
HOH2C
H+ O H2O
O
CH 2OH
2 CHOH
CH 2OH
以1→4位键合(1→4,6类似)
OH
H
O
H
OH H
O
0
H OH
IO-4
CH 2OH O
O
OHC OHC
CH2OH
NaBH4
O
O
O CH 2OH
HOH2C
黑暗搅拌反应，定时取样在222nm 测定光密度 值，直到光密度值下降到稳定为止（不再下降）。
第6章 多糖的结构分析
（1）高碘酸消耗量：用0.01mol/L标准碘液滴定高 碘酸消耗量
（2）甲酸成： 将样品溶液加少量乙二醇，放置10 分钟后（以中止反应还原剩余的高碘酸），然后用 0.01mol/L 氢氧化钠滴定甲酸的释放量。
第6章 多糖的结构分析
（2）多糖甲基化 精确称取纯多糖200mg，加35ml无水二甲亚砜，
通氮下搅拌至完全溶解后，加入18-20ml制备的负 碳离子液，通氮下搅拌4-6小时，然后加入8ml碘 甲烷，通氮条件下搅拌1-2小时后，停止通氮，继 续搅拌过夜。 注：糖液加入负碳离子后，液渐变为橙黄色；加碘 甲烷后液由混浊变清彻。
原端的单糖逐个被剥落的碱降解反应常称为“剥皮反应”。分 析多糖碱降解所得到的醛酸就可推断出原来单糖的键型。酶降 解反应发生在分子的非还原端。 过碘酸及其盐的氧化反应
多糖的非还原末端或非末端的（1→6）键与邻三元醇相似， 其与过碘酸盐作用则糖环开裂得到一分子比例的甲酸而消耗二 分子比例之过碘酸盐。非末端的（1→2）或（1→4）键与邻二 元醇相似，其开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸 盐。对于非末端的（1→3）键或C-2和C-4有分枝的则不受过碘 酸盐影响。因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的 生成和剩余糖的比例，就可确定多糖中各种单糖的键型及其比 例。
第6章 多糖的结构分析
一、组成成分分析
1、酸水解 1-3N硫酸，100℃，水解6-8小时。用碳酸 钡中和，G4漏斗过滤，蒸发皿蒸干。
气相色谱分析 纸层析（PG）：
展开剂： 正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5； 正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3
显色剂：常用硝酸银显色剂 A：16%硝酸银水溶液∶丙酮=1∶9（V/V） B：1%NaOH乙醇溶液（W/V） C：6 mol/L氢氧化铵
（甲醚甲基化糖）
以(1→4)葡聚糖为例:
OH（甲基化）
OH
4
H
O
H OH H
O
HO
H OH
O
H
OH
H
O
H
OH
n
OH
OH
O
H
H
O
OH
H
O
H
OH
H
O
HO
H
OH
OH
H OH
H
OH
H OH
OH
第6章 多糖的结构分析
O CH3
O
H
H3C
O O
CH3
O
H O CH3
O Baidu NhomakorabeaH3
O
H O CH3
H
O
O
n CH3
第6章 多糖的结构分析
三、结构研究的化学方法
完全酸水解 阐明结构的第一步就是鉴别多糖的单糖组成。多糖酸水解
是常用的方法。多糖水解的难易与其组分中单糖的性质、单糖 环的形状和糖苷键的构型等有关；含有糖醛酸或氨基糖的多糖 不易水解，α型较β型易水解，吡喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易 水解，呋喃糖苷键一般较吡喃糖苷键易水解。水解后中和水解 液，然后用层析方法分析，常用的层析方法有纸层析、纤维粉 薄层层析和气相层析。近几年这种酸水解方法分析已经达到完 全自动化。 部分酸水解
(3)确定分子式中含有的官能团（基本骨架等的结 构分析）
1、官能团的定性及定量 2、测定并解析化合物的有关光谱 （UV,IR,MS,HNMR,CNMR等） (4) 推断并确定分子的平面结构 1、 结合文献调研 2 、结合光谱解析及官能团定性定量分析结果。 (5)推断并确定分子的主体结构 1、测定CD或ORD谱 2、测定NOE,NOESY或ZD-NMR谱 3、进行X射线晶体衍射分析或人工合成
控制水解条件得到几个单糖连在一起的寡聚糖。水解得到 的较低分子量的寡聚糖可用凝胶过滤、离子交换和分配层析等 方法分离。其中最常用的为硅胶挤压层析和碳柱层析以及后来 发展起来的高压液相层析。解析寡糖结构较多糖简便的多，但 需减少回复现象，水解时多糖的浓度小于5%。
第6章 多糖的结构分析
碱降解反应 碱降解通常发生在单糖的羟基或羧基连接的酯上。多糖还
(2,3,6- O-三甲基Glc)
(2,3,6- O-三甲基Glc)
第6章 多糖的结构分析
(1)各种单糖甲基化衍生物的基峰均为43， 为CH3CO+ ;
(2)被甲基化，乙酰化的单糖分子中，带有 甲氧基的碳原子容易与相邻碳原子间发生断键，形成
正离子。
H
205 CH3 O
161
H
H 45
O COCH3 O CH3 117
结构研究的主要程序
(1)初步推断化合物类型 1注意观察样品在提取、分离过程中的行为。 2测定有关理化性质，如不同pH，不同溶剂中的
溶解度及层析行为，灼烧实验，化学定性反应等。 3 结合文献调研。
(2)测定分子式,计算不饱和度 1、元素定量分析 2、分子量测定 3、同位素峰法 4 、HI – MS等
第6章 多糖的结构分析
H
161
O CH3 205 O CH3 OCH3
断裂方式如下: 主要碎片(m/e)为：45.117.161.205
OCH 3
COCH 3 OCH 3
m/e161
-甲 醇
H2C
-乙醇
OCH 3
O COCH 3
m/e129
OCH 3 OCH 3
m/e101
-乙烯酮
H2C
OCH 3
OH
m/e87
-甲醛
OCH 3
第6章 多糖的结构分析
多糖结构测定的意义
从天然物质中分离得到的单体多糖化合 物即使具有很强的活性与具有较大的安全性， 但如果结构不清楚，则无法进一步开展其药 理学与毒理学研究，也就不可能进行人工合 成或结构修饰改造工作，更谈不上进行高质 量的新药开发研究，其学术及应用价值将会 大大降低。
第6章 多糖的结构分析
CH2 m/e71
由161、205进一步裂解为71.87.101.129.145。 OCH 3
实际所得碎片为: 45.71.87.101.117.129.145.161.205
OCH 3
O COCH 3
OCH 3
m/e205
-乙醇
OCH 3 OCH 3 OCH 3
m/e145
第6章 多糖的结构分析
4、多糖中的乙酰基定位 原理：利用甲基乙烯醚将多糖结构上的游离羟
基保护起来，脱去乙酰基，使结合的羟基游 离。对游离羟基进行甲基化，去除保护基团 并完全水解。单糖上甲基化的位置即是原始 多糖中的乙酰位置。
1 2位和1 6位键结合的经Smith降解后都有甘油产
生。（但1 2位结合的不产生甲酸，可供以区 别）。
1
4键合的，最后得到的是乙二醇和丁四醇（赤藓
醇）。
1 6键合的，最后得到的是甲酸、乙二醇和甘油。
1
4键合的戊糖聚糖，相应的产物是乙烯二醇和甘
油。
操 作 ： 高 碘 酸 氧 化 ： 多 糖 液 加 入 一 定 量 的 1520mmol/L 高碘酸钠溶液。
第6章 多糖的结构分析
（7）水解、还原和乙酰化 ①水解。完全甲基化的多糖真空干燥后，加85%甲酸
1ml，充N2 封管，100℃水解4小时，然后加甲醇蒸 除甲酸，至pH为67，真空干燥，再加入2 mol/L 三 氟乙酸2ml，100℃水解6小时，然后用无水乙醇赶除 三氟乙酸至中性，再用蒸馏水赶除乙醇。 ②还原。加入NaBH4 60mg还原24小时，室温磁力搅 拌；然后加入半匙阳离子交换树脂，磁力搅拌2小时， 定量滤纸过滤，向滤液中加入甲醇蒸除硼酸，真空干 燥; ③乙酰化。加乙酐、无水吡啶各0.5ml，封管，100℃乙 酰化2小时，然后移入蒸发皿，再反复加无水乙醇赶 除乙酐，然后真空干燥; (8)样品分析。产物干燥后，用少许氯仿溶解，进行GC 分析及GCMS分析。
第6章 多糖的结构分析
1、过（高）碘酸氧化 原理：可选择性断裂糖分子中连二羟基或连三羟基， 生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。 结果： 1 2或1 4键：每个糖基仅消耗一个分子的 高碘酸，无甲酸释放。 1 3位键：不被高碘酸氧化 1 6位键：消耗两个分子高碘酸，同时释放一 个分子甲酸。 然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸释放量。 防止发生超氧化：控制pH3-5；避光；空白对照实验
（3）降解：上述反应物加入1ml乙二醇、对蒸馏水 透析24小时。减压浓缩至小体积，加硼氢化钠还原。 用2 N 硫酸水解（100℃，6hr），碳酸钡中和
纸层析（需标样）、薄层色谱层析、气相层析
第6章 多糖的结构分析
3、甲基化（单糖残基的连接方式） 是用甲基化试剂将糖分子中的游离羟基
甲基化成甲醚，然后水解，检识这些甲基糖 产物，就可能推测组成多糖分子中单糖间连 接的位置（羟基所在的位置，即为原来单糖 残基的连接点）。 （氢化钠、碘甲烷） （1）制备负碳离子：无水二甲亚砜30ml于 100ml试剂瓶中，通入氮气几分钟后，加入 1.5gNaH，渐渐加温，然后恒温在65-70℃4-6 小时。最终颜色为墨绿色。整个过程通氮， 并搅拌。
第6章 多糖的结构分析
O
1 + H3C S CH3 NaOH
O H3C S
CH-2Na+
（二甲基亚砜）
（二甲基亚砜磺酰阴离子）
2 H3C
O
+ S CH-2Na+ R OH
（糖）
O
+ R O-Na+ H3C S CH3
（糖羟基-醇钠）
3 + R O-Na+ H3C I
（碘甲烷）
R O CH3+ NaI
3、碱降解 4、酶解
第6章 多糖的结构分析
二、糖与蛋白之间连接键型分析 β-消除反应 原理：糖温和条件下稀碱水解，可以把与肽链上丝 氨酸的羟基或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下 来。与天冬酰胺相连的N-型连键则不能被稀碱水解下 来。所以，β-消除反应在糖蛋白的结构分析中，常被 用来区别糖链的连接性质。 方法：将糖样品用浓度为0.2mol/L的NaOH溶解，在 60℃水浴反应1hr.。以0.2mol/L的NaOH溶液为参比， 在230-270nm范围内扫描。 结果判断：在270nm处无明显吸收峰增加，提示：糖 与蛋白之间的连接键属非O-型糖苷键。
第6章 多糖的结构分析
（3）透析 产物加蒸馏水稀释一倍，蒸馏水透析2-3天（换水）
（4）真空干燥（或冻干），得部分甲基化多糖，需进 一步甲基化
（5）进一步甲基化： 重复1-4的Hakomori methods 氧化银法
（6）产物：甲基化产物用氯仿溶解，萃取，收集氯仿 层，干燥得甲基化糖。 甲基化产物分析 气相色谱法。