液相色谱十大误区

误区一：HPLC柱不可反冲

否。通常液相色谱柱的设计的耐压值远高于最大操作压力（大约2倍）。因此，对于稳定的填料床，如果使用合适的流动相和合理的时间分配，填的好柱子能够左右开弓。反过来使用HPLC柱的原因有以下几点：换柱时反冲，清洗柱头强吸附的物质，以及冲洗出残留物质防止压力增大。

但是有一个特例，如果厂家在柱头使用了大粒度的填料，反冲会冲出这一部分填料。通常而言，出口处的填料粒度要比整支柱子最小的还要小。比如标称5μm的粒度，实际粒度在3-7μm，则出口处的粒度必须比3μm要小，这才能够保证柱子末端的填料不会被冲出去。

那么为什么厂家要在入口和出口处使用不同粒度的填料呢？因为大粒度的不容易堵，比如0.5μm的柱子比起同样2μm的柱子更容易堵塞。因此为了避免压力的快速升高，就要生产出更加有容差，大粒径填料入口的柱子。

博主注：柱子能不能反冲从我一开始接触就遇到了，有时候不管能不能，若是进过了脏东西，非要这样做不可，因为不可能让它沿着柱子跑一遍，费时费钱。实际上，能不能反冲直接决定于填料床的模型和实际填料到底有什么“添加剂”在里面，而这些资料waters，agilent，Phenomenex是不会给我们的。经验表明，反冲效果最好的是菲罗门，手上的不论是luna还是Synergi，都能够这样，其中一支更是创下了实验室反冲柱的神话–正过来寿终正寝，结果反过来又起死回生，用了接近一半的寿命，汗|||

误区二：所有的C18（L1）柱都相同

否。早期HPLC体系中，C18是唯一的反向色谱的键合固定相，因此C18就作为了反向色谱柱的标准并且许多先行者也乐于使用。因为医药工业最先采用HPLC，并且管理机构也不愿意厂家搞出新花样。FDA和USP也给出了提交新药品应用时设计的分析方法分类。给予了C18的HPLC柱子分类为“L”，因为C18色谱柱大部分作为提交新药的方法柱，C18就成为了L1，就是第一个标准柱。但更多的固定相出现，就以新的L值命名。（L7=C8，L10氰基，L11苯基）。

问题来了，因为商品化的C18合成条件不同，使用的不尽相同的作硅胶基体材料，就导致了反向柱有不同的性能。比如说：有的厂家使用一氯甲基硅烷，和小表面积的硅胶（如图），又有的使用同种硅烷，但是键合在大表面积硅胶上。这样就会导致大表面积的更像C18。低键合相优势会有未反应的硅醇羟基，能够导致混合的样品保留机理。所以厂商就使用二氯或者三氯硅烷，可以使硅烷流动属性降低，键合相就会薄一些。而为了使没有反应完的硅醇羟基消失，厂家就用小烷基封端来屏蔽（如三乙基氯硅烷）。硅醇基是中pH条件下简单化合物拖尾的始作俑者。所以许多厂家使用了双封端技术，就是用第二个小的硅烷来获得更加惰性的表面。厂家也使用了聚合物材料作为基体，然后多多少少键合C18，这就导致了柱子C18总量参差不齐，但依然还是作为C18（L1）来作为标准柱。也有的使用纯烷基硅烷键合，那么就表现出不同的反应特性，提供了与氯硅烷不同的C18键合相条件。

所以呢，此C18非彼C18在今天看来特别有意义。龙生九子，子子不同，因此用户分析开发的时候需要一致的柱子来获得稳健的方法。研究人员也开始研究哪些C18有类似的保留特点和选择性。所以就发现有的C18便显出完全与C18相反的特性。

博主注：只知道C18悠久，没有想到这么早，一般认为封端的就好些，比如大连国产的那个，用着用着柱效下降很快，我就认为和这个键合啊，封端啊有关系。

误区三：保护柱不影响分离效果

否首先，配一个保护柱很好。如果固定相选择错误，保护柱也能够对分离有效果。要明确的是：保护柱是保护分析柱避免被高残留的组分污染用的，尤其是那些不想进让它柱子的部分。保护柱比起分析柱便宜许多，所以污染的保护柱能够替换的更加勤。

理想的结果是，保护柱的固定相和分析柱恰好相同。如果固定相保留强（如高载碳量和混合相），就能够使得保留便宜而影响分离，甚至导致不同的选择性。如果保留弱，问题就不那么明显，除非固定相影响整个体系选择性。

为了使保护柱最小化的影响分离，保护柱需要合适的装配。显然，保护柱安插在进样口和分析柱之间，但是如果管路太长（太长或者内径太大），就会造成额外的峰展宽，从而影响分离。系统引入整合保护柱，从以往的报道看，基本上会达到分析柱的最佳水平。但是，整合保护柱基本上和卡式色谱柱捆绑，因此不是那么流行。从操作的角度说，应当在不影响HPLC系统的前提下容易卸下和更换。

理论上，如果保护柱延长了柱长，那么就对色谱分离有额外的塔板数。但就像前面说的，保护柱要么在最佳条件使用，要么在最糟糕的条件下除去。所以保护柱的优势就是延长柱寿命，而没有带来总体分析效率的提高。

博主注：最早接触保护柱，或者叫预柱，实在接触waters设备的时候，两个圆圆的盖子，仪器标配，缺点是不锈钢管路还那么长，简单的保护部分被拉出一大截死体积，后来菲罗门也送保护柱过来了，千把来块钱，一直放着也没有用，说句实话，笔者不是很喜欢用这个做保护，原因就在于觉得影响效果。

误区四：提高温度往往有利于分离效果

否。随着温度升高，流动相粘度下降，因此分析物传质速率提高，所以就能够提供更好的色谱分离效果。正确，但是除了柱效，温度同样影响保留因子（k）和选择性（α）。影响因素能够提高分辨率（其实这也是色谱分析最关心的问题），或者降低分辨率。保留时间往往随着温度升高而降低，因为温度作为一个热力学参数，使得高温度下分析物倾向于留在流动相中，会更快的洗脱出来。但是，不同的化合物，也有可能对于温度有不同的保留程度改变。以analgesics(一种镇痛药，译者注)为例，图二。这一系列的色谱图列出了分析物在

柱温20-90°C的情况。我们从中可以发现许多特点。首先，所有分析物随着温度升高，保留时间减低且峰变窄，意味温度升高利于分离效果。其次，salicylic acid（水杨酸即阿司匹林，译者注）在峰5，6之间，随着温度位置改变较大。事实是在20-40°C时，该物质随温度变化，洗脱顺序也发生了变化。所以，温度大于40°C会引起分离时间变短和洗脱顺序变化。

当然，一个提高温度的好处在于降低了操作时的柱压，以便于使用更大的柱流量和更细的填料。

另一个在高温下能够因此柱效的实验参数是流动相的热力学不匹配（互溶问题，译者注）。