007-高效生物分离介质的可控制备及其在生物分离技术的应用-江必旺

FLOW
色谱填料为什么要均匀颗粒？
填料颗粒越均匀，纵向扩散的就越小； 柱效高，峰形越窄，分离效率高。
单分散聚合物微球的合成方法
1. 传统悬浮聚合法合成“Gaussin”分布的微球
Dispersion Monomer Aqueous Polymerization
2. 种子法制备单分散微球
Swelling and Polymerization
30μm
50μm
纳微是全球第二家可规模化生产均粒聚合物色谱填料的公司, 拥有全球最全单分散聚合物色谱填料.常规粒径可选择1.7, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50微米,孔径可选择100,300, 500, 800, 1000埃. 纳微UniPS 系列产品可替换GE Source ， HP20SS，MCI Gel ， Amberchrom 等产品。
均粒高效全系列离子色谱填料
纳微离子交换色谱填料是以单分散聚苯乙烯和聚丙烯酸酯 微球为基质，通过表面亲水性涂覆及功能化合成的。具有 机械强度高，耐高压，流速快，产品批次稳定性好，非特 异性吸附低，载量大,分辨率高, 选择性好, 耐酸碱性优异 等特， 是实验室工业生物制品（抗体，酶，多肽，核酸 ，抗生素，胰岛素等）分离纯化的理想填料
微球表面亲水化及功能化技术
HN HO S HO COOH S HO O O COOH HOOC
微球表面亲水化及表 面功能化是生产高效 分离介质关键技术之 一，它直接影响到蛋 白生物活性和分离效 率。
Hydrophilic Coating HO HO HO HO HO OH OH OH Cl OH OH OH OH
多孔高分子微球
核
高分子
微球分离介质的孔道结构可以影响到分离效率、载量、 分离度, 对微球孔径的控制是开发分离纯化介质的关键技术之一。 纳微 已开发出100, 300, 500, 1000, 4000 埃的孔径聚合物微球。
Formation of Macroporous Particles
Aqueous Phase
大分子
聚苯乙烯 (表面改性)
中强
强
中
反相/离子/ 疏水/分子 筛/亲和
离子/疏水/ 分子筛/亲 和
大中 小分 子
GE, 三菱化学, Dow Chemical , Polymer Lab， 纳微
Tosoh，Biorad， 纳微
聚丙烯酸 酯 (表面改性)
中
中
中
大中分子
色谱技术随着填料技术的突破而发展
The most significant advances in chromatography have always followed the appearance of enhanced support matrices! Afeyan, N. B., Fulton, S. P., Regnier, F. E., J.
O
HO O HO
O
PS
PS
PS
O O OH
O
O HO
OH O O
Na2SO3
多孔聚苯乙烯 反向填料
表面亲水化 多孔微球
HO N HO O
N(CH 3)3Cl N O HO3S HO3S HO HO O O
亲和填料
强阴离子
OH N O HO OH HO OH PS N O O OH HO HO OH O N OH N
纳微发明了边溶胀边聚合种子 法制备单分散微球，可严格控 制微球的粒径大小及均匀性（ 发明专利200710124981.0 ）克 服传统悬浮聚合法合成的微球 显“Gaussian”分布的特点。
Uniform Enlarged Beads
Seed
单分散聚合物色谱填料
1.7μm 5μm 10μm
20μm
528.3 nm 710.3 nm
806.9 nm
954.7 nm
SEM Pictures of Uniform Microparticles
5 um 10 um
30 um
40 um
Microspheres With Various Pore size
各种形态的微球
SEM Picture of Microspheres
Chromatogr. 1991, 544, 267–279
色谱填料技术发展的过程
色谱填料基质的发展
Silica Gel 硅胶 Agarose 琼酯糖 Polystyrene/Polyacrylic 聚苯乙烯/丙烯酸酯
为什么色谱填料颗粒要均一?
装柱容易、反压低、流速快、柱效高 洗脱集中、洗脱体积少 重复性好
各种基质组成聚合物填料
OH HO OH OH OH O O O O O O O
O O O O
O O O
HO OH
OH O
N O
N O
O
极性增强
聚合物色谱填料可以通过表面改性及在聚合过程中添加功能性单体以改 变填料的选择性，纳微可为客户设计和生产专用色谱填料。
单分散多孔微球的制备方法
致孔剂 单体/致孔剂
AU
Min
Sample: Ribonuclease B、 Human Insulin, Cytochrome C、 Lysozyme、BSA Eluent A: 0.1%TFA in water Eluent B: 0.1%TFA in ACN Gradient: 20-40% B for 20 min Flow rate: 1 ml/min Detector: UV @ 214nm
OH N O HO OH HO OH PS N O O OH HO HO OH O N OH N HO O
N
O
弱阴离子
O
O
(CH 3CH2)2N
OH O HO OH HO OH PS HOOC S O O OH HO HO OH O S OH HOOC S COOH
弱阳离子
HSCH2COOH HO Protein A OH O O Protein A OH OH O Protein A HO OH PS O A Protein O OH HO HO OH O Protein A A Protein OH HO A Protein HO O O
纳微硅胶填料与国外知名品牌对比
Competitor 1
Competitor 2
UniSilTM
纳微开发出从分析到半制备到规模 化生产的各种超高纯硅胶填料，纳 微硅胶填料具有精确的粒径大小、 高度的粒径均匀性（CV<3%)、极高 的纯度（>99.99%) 、高比表面积和 优化孔径大小。
粒径分布图对比
Aqueous Phase
Polymer Particle
Microspheres With Various Pore size
孔径大小对分离的影响
1000 800 600 400 200 0 0 10 20 30 Uni PS 25-100 Uni PS 25-300 Uni PS 25-500 Uni PS 25-1000
强阳离子
HO3S OH O HO OH HO OH PS HO3S O O OH HO HO OH O SO3H OH SO3H
单分散多孔二氧化硅制备方法
氧化硅纳米粒子 高温 高温
多孔聚合物微球
聚合物/氧化硅复合微球
多孔氧化硅微球
用均粒多孔高分子微球做模板通过在孔道结构里组装氧化 硅纳米粒子形成聚合物/氧化硅复合微球,再通过高温处理可 以制备孔径和粒径可精确调控的单分散多孔氧化硅微球.
聚苯乙烯填料 VS 硅胶反相填料



聚苯乙烯和键合硅胶都可以用于反相色谱分析和分 离 聚合物和硅胶填料在分离分析选择上具有互补性 聚合物具有很强的耐酸碱性能且寿命长 聚合物填料在位清洗和在位消毒，批与批重复性好 硅胶机械强度高，柱效高，耐溶剂强 硅胶填料分辨率高, 是在HPLC 分析使用最早和最 普及的色谱填料
蛋白失活的主要原因




所有吸附都是动态的,蛋白在柱子的时间越长,失 活比例越大 高密度配基造成蛋白质容易在洗脱时形成聚集而 失活 通常蛋白质在pH8-10的弱碱性条件下比pH6-4 的条件下更稳定，因此蛋白质在阴离子交换的变 性比阳离子要少的多 疏水层析中的失活几乎完全是功能基团的疏水性 过强 金属螯合层析中的失活往往是金属离子泄露造成 的。
全系列单分散硅胶色谱填料
1.7μm 5μm 10μm
20μm
30μm
50μm
纳微可以生产从1.7 to 50 μm 任意大小单分散全多孔硅胶色谱填料, 常规孔 径可选择100, 120, 170, 300, 500 Å. 纳微UniSil 系列产品可以替换瑞典 Chromasil，日本Daisol, Fuji, YMC 等硅胶色谱填料。
RO
Monomer Droplet
Formation of Macroporous Particles
Aqueous Phase
Monomer Droplet
Formation of Macroporous Particles
Aqueous Phase
Monomer Droplet
Formation of Macroporous Particles
高效生物分离介质的可控制备及其在 生物分离技术的应用
江必旺 博士
苏州纳微科技有限公司
纳微苏州产业化基地
•创建于2007年苏州工业园区生物纳米园 •专业从事高精度,高性能纳微米球的研发和产业化 •员工110人, 研发和生产基地7500 m2
纳微核心技术-微球的可控制备
功能化球形材料的制备和应用研究是前沿、交叉的新兴领域，高性能微球制 备技术壁垒高, 可广泛用于诊断,药物缓控释,酶固定及生物医药的分离纯化 及检测等.
决定分离介质性能的主要因素
微球基质化学组成和物理性能 微球大小和粒径均匀性 微球形态，孔径大小和分布，孔容积，比表面积 微球表面功能团 及密度 微球的机械性能和化学稳定性，硬度等
微球的大小和分布
微球的形态
基质及表面特性
分离介质(色谱填料)主要材质
HO HO HO O OH HO HO HO O OH O O OH HO HO O OH O O OH HO HO O O O OH
精确控制微球大小及粒径分布 精确控制微球结构，如比表面积、孔径大小及分布 微球表面功能化技术 规模化生产及其应用技术
SEM Pictures of Uniform Nano/Microparticles
160 nm 260.3 nm
343.4nm
456.4 nm
SEM Pictures of Uniform Nano/Microparticles
O O O O O Si O Si O Si O Si O O O O O Si O Si O Si O Si O O O O O Si O Si O Si O Si O O O O
HO
硅胶填料
O O O O O O O
天然碳水高分子改性填料 (葡聚糖,琼酯糖等)
O O O
O O
O
O O
O
O
O O
O
交联聚甲基丙烯酸酯
交联聚苯乙烯
各种基质填料特性及其应用
材质 键合硅胶 机械 强度 强 化学 稳定性 弱 溶剂 溶胀性 小 分离模式 反相,/正相 目标分子 中小分子 生产厂家 Chromasil, Daisol , Fuji, 德 国Merck，纳微 GE, 博克隆
改性碳水 高分子
弱
中
中
离子/疏水/ 分子筛/亲 和
生物制药的生产过程
生物分离纯化介质国内外状况


生物制药的生产可分为上游发酵过程和下游纯化 分离过程，如何经济、高效从发酵的复杂组分中 浓缩、分离和纯化目标生物药分子已成为全球生 物制药的生产瓶颈 分离纯化技术还对生物药的分子形态、收率、质 量和成本具有关键作用 美国GE公司占据全球生物分离介质市场的80%以 上, 中国使用的生物分离介质基本依赖进口, 不仅 供货周期长, 价格远高于国际市场上30%以上, 而 且还每年价格增长10%以上
粒径Leabharlann Baidu小和分辨率的关系
800000 600000 400000
Uni PS 10-300 Uni PS 30-300 Uni PS 40-300
Absorbance
200000 0 -200000 -400000 -600000 0 10 20 30 40
Time
Sample: Ribonuclease B、 Human Insulin, Cytochrome C、 Lysozyme、BSA Eluent A: 0.1%TFA in water Eluent B: 0.1%TFA in ACN Gradient: 20-40% B for 20 min Flow rate: 1 ml/min Detector: UV @ 214nm