抗体展示
抗体综述PPT幻灯片
1) 大约214个氨基酸残基； 2) 分子量约24kD ； 3) 通常不含碳水化合物； 4) 每条轻链含有两个由链内二硫键所组成的环肽。 5) L链共有 两型：
– kappa(κ)与lambda(λ)， – 同一个天然Ig分子上L链的型总是相同的。 – 正常人血清中的κ∶λ约为2∶1。
1) 是分泌型IgA上的一个辅助成分，分子量约为75 kD， 糖蛋白,由上皮细胞合成，以共价形式结合到IgA分子, 并一起被分泌到粘膜表面;
又称分泌片（secretory piece, SP）
2) SC的存在对于抵抗外分泌液中的 蛋白水解酶的降解具有重要作用.
四、单体、双体和五聚体
1. 单体
• 由一对L链和一对H链组成的基本结构， • 如IgG、IgD、IgE、血清型IgA。
2. 胃蛋白酶的水解片段
① Nisonoff等最早用胃蛋白酶(pepsin)裂解免疫球蛋白; ② 裂解部位：铰链区H链链间二硫键近C端切断。
③ 裂解片段： • F(ab’)2：
包括VH、VH1和铰链区; F(ab’)2具有双价抗体活性，与抗原结合可发生凝集和沉淀 反应; 但不具备固定补体以及与细胞膜表面Fc受体结合的功能.
① Porter等最早用木瓜蛋白酶(papain)水解兔IgG，从而 获知了Ig四肽链的基本结构和功能。
② 裂解部位：IgG铰链区H链链间二硫键近N端侧切断。 ③ 裂解片段：共裂解为3个片段：
2 个 Fab段（抗原结合段，fragment of antigen binding）
• 每个Fab段由1条完整的L链和1条约为1/2的H链组成 • 分子量为54kD。
• 但能封闭和遮断抗原与完全抗体结合.
第三章 抗体(antibody)概论
免疫球蛋白分子结构（IgG）
高变区（CDR）
抗体分子结构
外形 “Y”形
链（chains)
2条重链(Height chains), 约55kD，550aa。
分类：根据H链恒定区氨基酸的组成和排列顺序不同， 将重链分为α、γ、 δ、 μ、 ε；Ig分为IgA、 IgG、 IgD、 IgM、IgE。
IgG3
(2) 四个亚类；
(3) 血清中含量最高(75-80%Ig)；
(4) 半衰期最长(21～23天)；
(5) 3～5岁达成人水平(8.0～17mg/ml)；
2.生物学活性 (1) 通过胎盘（新生儿抗感染）； (2) 激活补体（裂解细胞）； (3) 调理作用（促进吞噬）； (4) 介导ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒
单体/二聚 体
单体
160/385
184
10~15
＜1
IgE 单体 188 0.002
半衰期
23
5
6
3
3
出现时间
出生后 三个月
出生前
出生后四个 月
晚
晚
五大类免疫球蛋白特性比较（2）
与补体结合能力 中和作用 调理作用 ADCC 参与粘膜防御 能穿透胎盘 与细胞结合 参与超敏反应
IgG IgM IgA IgD IgE
Cesar Milstein
一、制备
二、应用
肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
三、基因工程抗体
问题产生——HAMA反应
Human anti-mouse antibody 抗体人源化—基因工程抗体
嵌合抗体 小分子抗体 抗体库技术
重组抗体举例
练习题
什么是抗体？主要功能是什么？ 简述抗体的分子结构和功能相关结构域？ 什么叫单克隆抗体？制备单克隆抗体的基本原
天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定
天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定DOC格式论文,方便您的复制修改删减天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)【摘要】目的构建库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体,ScFv)库,为进一步筛选ScFv奠定基础。
方法从健康自愿者的外周血淋巴细胞提取mRNA,经RTPCR分别扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)DNA,进而连接形成ScFv DNA。
将其连接TVector转化E.coli JM109大肠埃希菌,经蓝白筛选,挑取9个阳性克隆测序以鉴定ScFv组装。
通过体外转录和翻译对抗体文库进行初步鉴定。
结果VH、VL和ScFv DNA分别约为350、650和1 100 bp。
本试验成功构建ScFv核糖体展示模板。
结论成功构建天然的大容量核糖体展示人源性ScFv文库,为下一步利用亲和富集筛选技术获得各类ScFv奠定基础。
【关键词】抗体, 单克隆, 核糖体, 埃希氏菌属, 基因文库单链抗体(SingleChain fragment variant,ScFv)是通过基因工程技术方法把重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)连接而构建的重组蛋白,较之完整抗体具有分子量小、通透性高等特点,更适合用于药物靶向DOC格式论文,方便您的复制修改删减和免疫生物治疗。
构建ScFv可通过传统的杂交瘤技术或噬菌体展示技术制备,而近年来问世的核糖体展示技术(ribosomal display,RD)是一种不受细胞转染和表达等因素影响的完全细胞外展示系统工程[1],简化了ScFv的筛选过程,可望筛选到高亲和力的ScFv。
本研究选用健康自愿者的外周血淋巴细胞为材料,构建天然大容量核糖体展示ScFv文库,为下一步筛选各类ScFv奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料和试剂 mRNA提取试剂盒,瑞典Amersham公司,,Taq DNA聚合酶,T4 DNA连接酶,兔网织红细胞裂解液,T7 RNA聚合酶,rNTPs RNase inhibitor,美国Promega公司,,pMD18 TVector载体,日本Takara公司,,RNA抽提试剂盒,瑞士Roche公司,,脂多糖,LPS,美国SigmaAldrich集团公司,。
人源性肺癌噬菌体展示抗体库的构建
６ ０７ ０ｐ片段 者 为重 组 克 隆 ；噬 茵体 展 示抗 体 库 大小 在 １ １ 间 ；优 化 电转 化 条件 ，最 终得 到 库 容 为 １ ０－ ０ｂ ０－ ０ 之 ． ０ｃ ，双 链重 组率 为 ２×１。ｆ ｕ
４ ％ 的抗 体库 。结 论 异 亲和 力Байду номын сангаас的人 源性 单 克隆抗体 奠定 了基础 。 １
【 键 词】 噬 菌体 展 示 ；肺 癌 ；抗 体 关
中图分 类号 ：Ｒ ３ ． ７４２
文献 标识 码 ：Ｂ
文章 编号 ：１ ７－ １４ （Ｏ Ｚ ９ ０２ － ３ ６ １ ６９ ２ Ｌ ）１－ ０２ ０
Ｂｉ ｃ ｍ ｘＬｕｎｇ Ｃａ ｅ ｏ ｈｅ Ｓｅ ｎｃ ｒＰｈａ ｉｐ ａ ｇｅＤ ｓ ｌ ｙ Ａｎｔｂｏｄｙ Ｌｉ ｒ ｒ ｎｓｒ ｔｏｎ ｉ ｂ ａ ｙ Ｃｏ ｔｕｃｉ
试 剂 盒提 取淋 巴细 胞 Ｒ Ａ，以 ＯｉｏＤ Ｎ ｌ Ｔ为 引物 反转 录合 成 ｅ Ｎ ｇ Ｄ Ａ，以半 套 式 Ｐ Ｒ扩增 轻链和 重 链 可 变 区抗 体 基 因 并重 组到 原核 表达 载 Ｃ
体 中，通 过噬 茵体 外壳 蛋 白形 成 融合 ＮＡ有 清 晰 的 ２ｓ １ｓ ５ ｓ 条带 ， ８、 ８ 和 ． 的 ８
抗体fab2段
抗体fab2段以下是有关抗体fab2段的内容：常规抗体常规的抗体或者是完整大小的抗体是被称为免疫球蛋白的糖蛋白，是浆细胞对外来分子或者抗原反应后产生的。
抗体最基础的功能是结合特异性抗原并激发免疫反应，从而保护机体免于感染。
抗体包括好几种亚型，这里主要是介绍IgG和IgM亚型的抗体。
IgG和IgM亚型的抗体被广泛应用于科研、诊断和治疗等方面。
1.常规抗体的结构一个完整的抗体的基础单元结构有四条肽链组成，包括两条重链和两条轻链，并通过二硫键结合在一起。
抗体的形状像一个Y字母，Y结构的铰链区具有弹性。
每条肽链就有一个恒定区（在所有的抗体中都非常的保守）和一条可变区（在一个种抗体中都是特异性的）。
轻链可变区的标示符号是VL，而轻链恒定区的标示符号是CL（图一左）。
类似的，重链的可变区和恒定区分别被标示为（VH）和（CH）。
碳水化合物通常和重链的CH2区域结合。
Fc 段只包括重链的恒定区（CH）, 但是和抗原结合的Fab段（Fab）包括一个恒定区和重链的可变区以及轻链的可变区（VH and VL）。
Fv区域（variable fragment）只包含两个可变区一个完整的常规抗体（左）和通常的抗体片段（右）的基本结构2.常规抗体的应用常规抗体在科研中用于通过蛋白质印迹、免疫组织化学以及酶联免疫吸附法等方法检测目的蛋白已经有几十年了。
完整大小的抗体还被应用于临床的检测，比如妊娠试验以及用ELISA检测血液中HIV病毒。
另外，常规的完整的抗体还被应用于疾病的治疗。
例如，英利昔单抗是一个可以识别肿瘤坏死因子的抗体，被用于治疗肠道疾病和类风湿性关节炎。
曲妥珠单抗或者赫赛汀是一种可以结合上皮生长因子二的抗体，被用于治疗转移的乳腺癌。
另外，还有好多抗体，包括Muromomab，被用于器官移植后的基础治疗来防止发生移植物排斥反应。
用常规抗体的优点包括Fc区域能够激活机体的免疫反应并结合到目标分子上使之被破坏。
用完整抗体的缺点包括由于其分子太大不能被渗入到某些组织中。
各种抗体的特点
各种抗体的特点
各种抗体的特点
抗体（Antibody）是由动物的免疫系统产生的一种蛋白质，在人体及其他动物体内，它有着强大的识别及杀伤微生物等外源物质的功能，因而具有重要的抗病毒、抗细菌的作用，在临床上也显示出它的重要性。
目前，已经发现有大约一百种抗体，每种抗体都有其特定的功能。
1、IgG抗体：IgG抗体是一种抗体，大多数人体免疫系统能出现的最多的抗体类型，约占人体抗体的75％以上，其抗原性强，可通过血液循环进入组织，可与抗原结合细胞表面，从而杀伤病原体，也可与多种细胞相互作用，参与免疫应答的调节。
2、IgA抗体：IgA抗体是一种在宿主体内的抗体，主要位于粘膜表面、消化道及呼吸道，其具有良好的结合性，可以有效地阻止病毒及细菌的入侵，同时也可以抑制炎性因子的产生，有效地防止细菌性的疾病。
3、IgM抗体：IgM抗体是一种体内最早出现的抗体，其主要参与早期免疫反应，同时也可与抗原结合，造成细胞溶解性的抗原结合抗体，从而能有效地抵抗外源性抗原。
4、IgE抗体：IgE抗体是一种特殊的抗体，能够在与抗原相互作用时，引起各种变态反应，从而有效地抵御病原微生物入侵。
5、IgD抗体：IgD抗体是一种能够结合表皮细胞的抗体，其能够有效地阻止病毒及细菌的入侵，保护宿主体的健康。
6、IgG抗体：IgG抗体是一种能够结合抗原及其他外源性物质的抗体，能够结合抗原细胞表面并发挥杀伤性，从而有效地抵御入侵性的细胞及病原体，有助于宿主体的健康。
核糖体展示单链抗体库技术及应用的研究进展
一
用方面取得 了很大进展。现就这方面的研究进展作一综述 。 关键词 ： 核糖体展示 ； Ｒ Ａ一 ｍ Ｎ 核糖体 一蛋 白质三聚体 ； 单链抗体
术 的基础 上改 进而 来 ， 是一 种 利用 功 能性 蛋 白相
／ — Ｒ ＴＰ ｃ
一
休转 ＼ 外 录＼
． ．
。
…
．． ．
。
Ｉ 解 离
翻 译
一
核糖体 一 白质三联体复合物 蛋
互作 用进 行 筛 选 的新 技 术 。该 技 术 完 全 在 体 外 进 行， 其文 库容量 不受 细胞转染 效 率的影 响 ， 库容量 和 筛选效 率得到 很大 的提高 。而且 它可与 其他技术 相 组合 ， 在体 外 分 子 定 向进 化 方 面 具 有 独 特 的优 势 。 目前 ， 核糖 体展示 技术 在 单 链抗 体 的 构建 及 应用 方
维普资讯
６ ２
２０ ０ ８年 第 ３ 第 ３期 ６卷
Ｐｏ ｉｒ ｉ ｕｏ Ａ ｚ２０ ． ｏ．６Ｎ ． ｒｇｉ Ｍ ｃ ｂｏ Ｉ ｎｌ ｕ．０ ８ Ｖ １ ｏ３ ｎ ｏ ｌｍｍ ３
核糖 体 展示 单链抗 体 库技术 及 应用 的研 究进 展
物 同前 。最后得 到 的抗体 片段 ， 端 接上 １ 启动 子 ５ ＿ ７
成 茎环 结 构 ， 以便 使 ｍ Ｎ Ｒ Ａ不 被 核 酸外 切 酶 降 解 。
一
和茎环结 构 以及 Ｓ Ｄ序列 ， 端则 融合 了间隔序列 并 ３
含有茎环 结构 。另外 ， 可将 展示 的 Ｄ Ａ片段插 入 还 Ｎ 核糖 体展示质 粒 （ ｌ ｍ ｄｏ ｒ ｏｏ ｅｄｓｌ ｅｔ ， Ｐａ ｉ ｆ ｉ ｓｍ ｉ ａ ｖｃ ｒ ｓ ｂ ｐｙ ｏ ｐ Ｄ 的必需 元件 中， 用 带有 １ Ｒ Ｖ） 再 ＿ 动 子 和 ７启 Ｓ ａｅ 的 引物扩 增重组 质 粒 ， 得 Ｐ Ｒ产 物可 直接 ｐ ｃｒ 所 Ｃ 用 于体外 转录和 翻译 。
鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用
鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用徐重新;张霄;张存政;刘媛;仲建锋;董飒;胡晓丹;林曼曼;刘贤金【摘要】构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料.从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成cDNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因.采用重叠延伸PCR (SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库.以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性.以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性.经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76 μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上.经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因.电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×108.随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性.以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强.%A large phage display antibody library of mice for ScFvs screening and application research was constructed to obtain the independent intellectual property of the library.Extraction total RNAs from spleen cells of mice,then reverse transcribed them to cDNAs.Amplification of heavy chain gene (VH) andlight chain gene (VL)fragments with PCR,design two complementary Linker sequences and add to VH and VL respectively.Splicing VH-Linker and Linker-VL sequences by overlapping extension PCR (SOE-PCR) to a whole ScFv.Then clone ScFv into the pCANTAB-5E phagemid vectors,after being digested by restriction endonuclease (Not Ⅰ、Sfi Ⅰ) and linked by T4DNA ligase.Obtained primary phage display antibody library with over-night cultured that the pCANTAB-5E-ScFv recombinant plasmid introduced into E.coli TG1 by electroporation.The capacity of this library was calculated by monoclonal colonies.To analyze the diversity of thelibrary,the amino acid sequences of monoclonal colony phage ScFv in variable regions were alignment.We made Bt toxin proteins as coating antigen to verify its practicality by screening ScFvs which had antigen binding activity from the library.After detection,the total RNAs had clear bands an d its concentration was 2.76 μg/μl.We could clearly find bands of VH and VL by agarose gel electrophoresis and their complementary Linker genes were added respectively.Finally,the VH-Linker and VL-Linker were spliced to ScFvs by SOE-PCR and cloned into the pCANTAB-5E phagemid vector successfully.We obtained the primary phage display antibody library with a capacity of 3.67×108.By sequencing and sequence alignment of 12 monoclonal colonies phage ScFvs from random selection,we could determin the ScFv were from mice and the library had high diversity.After four rounds of panning in the library with three kinds of Bt (Cry1 B、Cry1 C、Cry1 F),the ScFvs which could combine with Cry1 B、Cry1 C、Cry1F were obtained.The results showed that this library had a stronger practicality.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2017(033)001【总页数】8页(P210-217)【关键词】噬菌体展示库;单链抗体;重叠延伸PCR;噬菌粒载体;Bt毒素【作者】徐重新;张霄;张存政;刘媛;仲建锋;董飒;胡晓丹;林曼曼;刘贤金【作者单位】江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014;江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室,农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】Q936噬菌体展示抗体库构建技术是伴随分子生物学、分子免疫学发展起来的新型基因工程抗体改造技术，是第3代抗体的重要载体[1-3]。
抗体(Antibody,Ab)基本结构和作用
IgD在B细胞膜上出现，是B细胞成熟的 标志。这些B细胞都难以产生免疫耐受 性，而B细胞膜上只有IgM而无IgD时， 容易因相应抗原作用而形成免疫耐受。
五类免疫球蛋白特性比较
Ig种类
IgG
IgM
IgA/SIgA IgD IgE
IgA不能激活补体的经典途径， 但能激活补体的替代途径。不能作 用为调理素，但能凝集颗粒性抗原 和中和病毒。
SIgA
分泌型IgA是机体 粘膜防御感染的 重要因素。
在保护肠道、泌 尿生殖道、乳腺 和眼睛抵抗微生 物入侵方面起关 键作用。
4、IgE
IgE为单体分子； 分子量190kDa，在血清中含量最少，约为
IgM和SIgA结构示意图
（二） 功能区
用X射线衍射分析法发现，Ig多肽链是由若干折叠 成球形结构组成的一种立体构型。 每一球形结构是肽链的一个亚单位，约110个氨基 酸组成，具有一定的生理功能，故称功能区(或结构域)。 在功能区中氨基酸序列有高度同源性。 L链有VL、CL两个功能区； IgG、IgA、IgD的重链有VH、CH1、CH2、CH3共四个功 能区；IgM、IgE重链则有VH、CH1、CH2、CH3、CH4五个功 能区。
0.01~0.9%；
种系进化中出现最 晚；
由呼吸道和胃肠道 浆细胞产生；
IgE
人和动物血清中浓度 很低，但它有独特的 Fc区，能结合肥大细 胞和嗜碱性细胞，可 引起I型超敏反应。
IgE还与对蠕虫侵袭的 免疫应答有关。
IgE在56℃ 30min即被
5、IgD
血清中含量极少，为Ig总量的1%左右。 IgD为单体分子，血清中IgD的功能尚 不清楚。
噬菌体表面展示及其应用
Solid phase selection with immunotubes
Immunotube coated with antigen
coated with
steptavidin and
biotinylated antigen
B
v v
B
B
B
BB
B
Solution phase selection with biotinylated antigen
用于外表展示的噬菌体
• 3种常用于外表展示的噬菌体为 M13, F1 , FD• 利用病毒粒子外表蛋白构建多肽，每 个噬菌体能展示一个任意的多肽
噬菌体外表展示的筛选• 利用筛选技术能从 噬菌固定靶 蛋白/多肽
• 利用DNA测序的优 势，很容易就能鉴 定目的蛋白/多肽的 序列
感染 和扩增
E.coli
噬菌体抗体库的构建
Antibody IgG structure
Fab
VL
CL VH
CH1
Fc
CH2
CH3
Hinge
(Fab’)2
Membrane Extension
Fv
VL
VH
CL
CH1
CH2 CH3
VL
Fv VH
VL
scFv
VH
宿主细胞: 筛选范围 : 107 109 时间: 操作: 单
antigen biotin
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
去除未结合的噬菌体病毒粒子.
洗脱结合的噬菌体
Amplify eluted phage
Repeat selection
抗体噬菌体展示
Periplasmic Stress Response Systems-two Systems
• Stress: heat shock, hyperosmotic shock, expression of outer membrane proteins defective in folding, pH etc.
• The pIII protein domain N1 is required during infection for the translocation of the DNA into the cytoplasm and the insertion of the coat proteins into the membrane.
• Cpx pathway, regulate DsbA, RotA, and PpiD, DegP, CpxP
• It is composed of CpxA and CpxR.
Phage-display Vectors
Phage Display Vectors-M13KE, Wild-type
• Infection is a multistep process requiring interactions with the F conjugative pilus and the bacterial TolQ, R, and A cytoplasmic membrane proteins.
• Heat shock response-σ32, inducing production of proteins, control of PpiD catalyst
• σE pathway, control the synthesis of at least 11 proteins, such as DegP, FkpA • RseA, ResB are negative regulators of σE
单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定
浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis , 2021,33(1) : 27 - 33htt y ：//www. zjnyxb. cn徐海，王健，郭长明，等•单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定[J ] •浙江农业学报,2020,33(1)： 27 -33.DOI ： 10. 3969/j. issn. 1004-1524. 2021. 01. 04单域抗体T7噬菌体展示文库构建与鉴定徐海1，王健S 郭长明S 董洪燕S 邓碧华2,侯继波2!*收稿日期:2020-05-O基金项目：江苏农牧科技职业学院院级课题(NSF201902)作者简介:徐海(1982-),男，江苏扬州人，硕士，副研究员，主要从事噬菌体展示技术研究与应用)******************** 通信作者,侯继波，E-mail ： houjibo@jaas. ac. cn(1.江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州225300； 2.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所，江苏南京210014)摘要:优化噬菌体展示文库构建策略，获得高品质羊驼源天然纳米抗体T7噬菌体展示文库,并对文库质量 进行鉴定。
分离羊驼外周血淋巴细胞,提取总RNA ,RT-CR 扩增羊驼重链抗体可变区(VHH )基因，插入T7 select 415-1b 噬菌体载体构建文库，计算文库的库容量，测定文库传代稳定性。
测序分析VHH 基因的多样性和纳米抗体氨基酸序列特征。
Western-blot 检测纳米抗体在噬菌体表面的表达情况，电镜观察文库中重组噬菌体颗粒形态。
结果表明,构建羊驼源纳米抗体T7噬菌体展示文库,有效库容达到2. 73 i 109 PFU ；纳米抗 体与羊驼源抗体同源性高,氨基酸序列显示纳米抗体特征区域,并其在噬菌体表面高拷贝表达;重组噬菌体颗粒结构完整,但随着传代出现插入基因的丢失) 关键词：羊驼;纳米抗体;T7噬菌体;表面展示中图分类号:Q939. 48 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2021)01-0027-07Construction and idenhbcahon of nanobody T7 phage display libraryXU Hai 1 , WANG Jian 1 , GUO Changming 1 , DONG Hongyan 1 , DENG BiPua 1 , HOU Jibo 2' *(1. Jiangsu Key Laboratoroyor High-TecC Research and Development f Veterinare Biophargaceuticals , Jiangss Agri-afimal Huseandre Vocational College , Taizhoo 225300, China ； 2. Institute fg Veterinare ymmunology & Engineer ing , Jiangsu Academy of Agricdtural Sciences , Nanjing 210014, China )Abstract: To construct a high-quality natural alyaca nanobody phage display librara by strategy optimization, ands0stematica a identieied thequaait oetheaibeae , thetotaaRNAwasisoaated eoempeeipheeaabaood mononucaeaece aoe6 aapacasand then eeveeseteansceipted intocDNA.The VHH genewasampaieied and inseetintopaasmid and T7seaect415 -1 b vectoe , eespectivea , toconsteuctpaasmid and phagedispaa0aibeae.Thephageaibeae wasidentieiedb0voaumecaacuaating , peopagatingstabiaittestingand sequencing.Theexpee s ion oenanobod0wastested b0West- een-baot , and thesteuctueeoephagepaeticaesweeedetected b0eaecteon miceoscop0.Resuatsshowed thatthee e e ctive volume of phage librae was 2. 73 i 109 PFU , and VHH nanobody was successfully displayed on T7 phage surface inhigh copynumbNe.SNquNncNanaaysisshowNd thatVHH nanobodyhad high homoaogywith aapacaantibody.RNcom-binantphagNpeNsNntd intactpaetica steuctueNthNsamNasthNdonat T7 sNact415-1 b phagN.HowNvNe , dueingcontinuouspa s agNapaetoeeNcombinantphagNswouad aostthNinsNetVHH gNnN , which indicatd thatonayaowNe-gNnNeation phagNaibeaeycouad bNusNd eoea e i nitysceNning.Key words: alyaca ； nanobody ； T7 phage ； surface display-28-浙江农业学报第33卷第1期1985年Smith首次利用丝状噬菌体表达外源基因，开启了噬菌体展示技术的研究［1'2］o将外源DNA片段插入噬菌体基因组中，使外源基因与噬菌体衣壳蛋白基因融合表达，所编码的外源蛋白被展示在噬菌体的表面，其最大优势在于将基因型与表型进行统一。
噬菌体展示技术在纯化埃博拉病毒抗体过程中的应用
【5】龚香艺[2,3] 丁重阳[2,3] 刘立明[2,3] 吴静[1,3]；一种增加重组毕赤酵母拷贝数提高胰岛素前体产量的策略；《微生物学报》2013年第53卷第6期 545-552页
【6】喇文军；蛋白质、蛋白酶以及短肽类的分离提纯技术及应用；《食品工程》2008年第1期 15-18页
【7】张蕾马凡舒 闫喜军 徐淑娟；单克隆抗体制备的关键因素；《特产研究》2015年第37卷第1期 69-71页。
6.利用普通噬菌体与结合了埃博拉病毒衣壳蛋白+绿色荧光蛋白质量的不同电泳分离它们，取得纯粹的埃博拉病毒衣壳蛋白抗体噬菌体；
7.取部分该噬菌体，破坏其蛋白质外壳，得到其DNA，测序找出插入其中的抗体蛋白并利用PCR技术扩增该片段；
8.构建表达载体，将该段DNA利源自crisper技术定点敲入【3】，替换酵母菌的分泌蛋白基因位点，而后使该酵母菌繁殖；
参考文献
【1】李晓莉，姚慧，周登远，焦振山；噬菌体展示抗体库技术的研究进展及临床应用；国际生物医学工程杂志2010年2月第33卷第一期。
【2】国文 ，刘积平 ，王启栋 综述；刘 玮 审校；埃博拉病毒病的研究进展；武警医学2015年7月第26卷第7期。
【3】Wikipedia CRISPR
【4】维基百科，埃博拉病毒
9.繁殖到一定数量后取培养液上清液，利用柱层析法【5】提取埃博拉病毒抗体蛋白，制成疫苗。
利用噬菌体载体展示抗体文库技术研究进展
等他８１构建辅助质粒，发展了不使用辅助噬菌体的噬 菌体展示技术，建克了含有辅助质粒的细菌包装细
胞系。
［１５］Ｔａｄｊｉｎｅ Ｍ。Ｍｉｔｔａｌ
ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｕｎ ｏｆ
Ｋ Ｒ，Ｂｏｕｒｄｏｎ Ｓ．ｅｔ
ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ（・ｈａｒ—
ｍｕｒｉｎｅ
ｎｍｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈａｅｍｏｐｈｉ— ｒｏｌｅ ｉｎ
１．３
ｏｕｔ
Ｔ４噬菌体展示系统
通过小外衣壳（ｓｍａｌｌ
ｃａｐｓｉｄ，Ｓ（）Ｃ）蛋白（：端与外源多肽融合进行展
示。ＳＯＣ的分子量为９ｋＤ，是Ｔ４组装所必需的，而 且不论在体内还是在体外，都具有与成熟衣壳表面 特定位点高结合能力。王新卫等ｕ２。利用重组噬菌 体Ｔ４一ｚｌ—ＮＰ作为诊断抗原建立了检测ＡＩＶ抗体的 Ｅｌ。ＩＳＡ方法，为进一步利用Ｔ４噬菌体展示系统开
多，Ｏｓｂｏｕｒｎ Ｊ¨＂等将抗原包被于固相介质上，加入
辅助噬菌体与噬菌粒载体的关系 当外源ＤＮＡ序列是噬菌体扩增不欢迎的，往
往会导致重组体不稳定，外源ＤＮＡ在子代噬菌体 基冈组中会出现缺失或重排。这种情况下可以通过 辅助噬菌体趟感染转化细胞，以杂和噬菌体颗粒的 形式展示外源ＤＮＡ片段编码的氨基酸序列。由超 感染细胞所分泌的噬菌体颗粒在表型上是混合的， 一些外源序列以“单价”的形式被展示，这对于选择 以高亲和力结合到靶序列的配体时是非常有益的。 辅助噬菌体能够使噬菌粒转化培养物超感染后包装 入噍菌体颗粒的单链噬菌粒ＤＮＡ的得率最大化。 辅助噬菌体的复制与装配不如噬菌粒有效，冈此在 超感染细胞所分泌的噬菌体中，衣壳中含有压倒性 多数的展示有靶序列的农壳蛋白。有研究者设计新 型的辅助质粒代替辅助噬菌体∽∞，进一步避免野生
抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选
抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选刘亚文;张晓;郭万美;谢英林;宋水燕;朱晓宇;敬媛媛;于建立;宋海鹏【摘要】利用噬菌体展示技术进行纳米抗体库的构建和筛选,获得抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,为相关癌症诊断及靶向治疗的应用奠定基础.使用重组CEACAM5抗原免疫羊驼,分离免疫后羊驼的外周血淋巴细胞,提取总RNA后通过RT-PCR技术扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段,构建纳米抗体文库.采用噬菌体展示技术和固相淘选方法,筛选得到强阳性克隆,经大肠杆菌表达和镍离子亲和层析获得纳米抗体,最终利用Biacore分析其亲和力和特异性.通过3轮的淘选,获得一株纳米抗体亲和力达到2.6×10-10 m ol·L-1,对同源性蛋白CEACAM-1、-3、-6、-8及肿瘤蛋白AFP均无交叉反应性.利用噬菌体展示技术成功获得了抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,可用于后续相关癌症诊断和靶向治疗.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2018(018)028【总页数】6页(P189-194)【关键词】癌胚抗原;纳米抗体;噬菌体展示;亲和力;特异性【作者】刘亚文;张晓;郭万美;谢英林;宋水燕;朱晓宇;敬媛媛;于建立;宋海鹏【作者单位】长春理工大学生命科学技术学院 ,长春130022;长春理工大学生命科学技术学院 ,长春130022;长春理工大学生命科学技术学院 ,长春130022;吉林亚泰生物药业股份有限公司 ,长春130033;吉林亚泰生物药业股份有限公司 ,长春130033;吉林亚泰生物药业股份有限公司 ,长春130033;吉林亚泰生物药业股份有限公司 ,长春130033;长春力太生物技术有限公司 ,长春130000;长春理工大学生命科学技术学院 ,长春130022;长春力太生物技术有限公司 ,长春130000【正文语种】中文【中图分类】Q816癌胚抗原(CEA)是哺乳动物细胞表面免疫球蛋白超家族的一员[1]，属于细胞表面粘附分子，其最早从人类结肠癌和胎儿消化系统中鉴定出来。
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噬菌体抗体库技术的诞生和迅速发展，则为犬瘟热的防治研究提供了新的思路和方法。
噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入第三次革命。
噬菌体展示技术目前以噬菌体展示抗体的应用最为成熟，噬菌体抗体库技术是噬菌体表面展示技术在基因工程抗体应用上的一个成功范例。
它可以模拟体内B淋巴细胞受到刺激后分化、成熟直至分泌抗体的过程。
建库时一般先从外周血淋巴细胞或脾细胞中提取RNA，设计核酸引物，用PCR技术扩增出所需要的整套的抗体基因片段，通过抗体轻链和重链基因的随机重组，构成单链抗体基因，如Fab或scFv，将其插入噬菌体或噬菌粒表达载体中，与噬菌体外壳蛋白基因连接，感染大肠杆菌并以融合蛋白的形式使抗体片段表达展示于噬菌体表面，形成含有全套抗体谱的噬菌体抗体库。
利用抗原－抗体的特异性结合进行淘选，获得能与抗原特异性结合的阳性克隆。
噬菌体抗体库技术是基于噬菌体表面展示技术发展起来的一项基因抗体工程新技术。
它将含亿万种基因的抗体可变区基因库转化成展示在噬菌体表面的蛋白库，不仅使对于具备所需属性的单克隆抗体筛选能更方便、快速、高效地在体外进行，还开辟了单克隆抗体的新途径，揭开了单克隆抗体生产的历史新篇章。
噬菌体展示技术不需经过杂交瘤，甚至不需经过免疫，直接从B细胞mRNA反转录的cDNA扩增出抗体基因，避免了从取脾细胞融合到获得稳定克隆株的繁琐过程。
用杂交瘤技术制备单克隆抗体是抗体工程中最经典的方法，噬菌体展示技术与之相比，具有很多优点：它的筛选范围从几千扩大到几百万甚至几亿，可筛选不同亲和力的抗体，而且简单、快速、高效。
利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体，随着此项技术的发展，噬菌体抗体库技术将为未来十年的药物研制和靶分子确定提供研究工具和发展平台。
噬菌体抗体库技术发展至今，已可在两周内根据各种分子筛选出相应的具有高亲和力的抗体。
它在考虑到抗体分子的大小、价数、亲和力及效应区功能的同时简化了抗体生产程序。
McCafferty按照设计的实验步骤将Fabs，单链Fv展示于丝状噬菌体表面，噬菌体抗体库产生的抗体有中度的亲和力，分离常数在10-5 mol/L～10-8mol/L时，展示的抗体可被靶分子结合而被筛选出来。
除此之外，抗体片断还可通过某些方法如形成二聚或多聚体分子来增加结合部位，以达到增加抗体的亲和力或价数的目的。
噬菌体抗体库技术诞生以来，由于方便、快速、高效等特点，其应用得到了迅猛发展。
目前用于临床实验的人类抗体中，有30％是由噬菌体抗体库技术获得。
临床上发展最为成熟的噬菌体抗体D2E7-抗TNF2IgG1抗体，已经申请用于临床治疗风湿性关节炎。
运用噬菌体抗体库技术，已建立起了多种抗体库(合成的，天然的，svFv，Fab等) 和肽库(线性的，环形的等)。
噬菌体抗体库技术一诞生，就在抗病毒抗体研究中显示强大功能，多种类型抗体库得到建立，多株针对不同病毒的抗体已被分离得到。
针对多种不同病毒抗原的单克隆抗体片段或功能性肽段也已筛选得到并已用于病毒性疾病的检测和诊断。
噬菌体抗体库技术目前已广泛应用于筛选针对SARS-CoV、埃博拉病毒、HIV、流感病毒和乙型肝炎病毒的抗体，其他各种人类病毒的抗体，如呼吸道合胞病毒（RSV）、丙肝病毒（HCV）等。
除此之外，针对口蹄疫病毒、狂犬病毒等以及多种植物病毒如葡萄扇叶病毒等的噬菌体抗体库研究都已广泛开展，多株特异性噬菌体抗体已被筛选得到并已用于疾病检测和诊断。
随着连续抗原淘选等方法的发明及应用，噬菌体抗体库技术将为病毒性疾病的特异治疗带来新的发展。
鉴于目前的各种CDV检测方法存在一些难以克服的缺点, CDV疫苗还存在很多的不足之处。
应用噬菌体抗体库技术可筛选出抗犬瘟热病毒抗体，经载体表达出可溶性svFv（single chain variable fragment）。
可溶性svFv具有穿透力强、容易到达靶细胞等优点，可广泛应用于犬瘟热病毒的检测及犬瘟热病的治疗和致病机理研究。