周建平药品热原检查与细菌内毒素检查方法介绍

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检查法
1、取合格兔，停食、停水，称重并固定约1小时
2、每隔30分钟测温一次，致连续2次温差≤ 0.2℃，并算得2次均值为正常体温。
3、及时配制供试液并预热至37～38 ℃
4、选兔并分组（初试3只/组、组内温差＜1.0℃ ； 复试5只/组）
5、注射供试液（分组后15分钟内）
6、计时开始并记录6次体温，间隔0.5小时，以6 次中最高温度减去该兔正常体温为升温值
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结果判断
1、复试：初试3只兔中仅1只升温≥0.6℃或 3 只兔升温均小于0.6℃、但升温总和≥1.4℃，
应另取5只复试。
2、合格：初试3只兔升温均小于0.6℃且升温 总和＜ 1.4℃； 5只复试中仅1只升温 ≥0.6℃且初试、复试共8只兔升温总和≤ 3.5℃。
家兔热原实验中的热原阈值剂量应当认为是最低 标准，对于人体而言应尽可能的提高几倍实验的 安全范围。
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热原检查法基本操作
实验材料及设备 新兔预选
实验准备
家兔重复使用
实验动物
检查法
实验环境 供试液配制
结果判断（合格、复试、 重做、不合格）
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实验材料及设备
药品热原检查与细菌内毒 素检查方法介绍
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北京市药品检验所药理室 周建平
2005年11月
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药品安全性检验内容
热原检查（Pyrogen Test) 细菌内毒素检查（Bacterial Endotoxin Test） 异常毒性检查 降压物质检查 过敏法反应检查法 降钙素生物测定法 生长激素生物测定法 溶血与凝聚检查法
体重增长较缓慢 动物的检疫、标记：一周的检疫期，动物编号和笼
具编号
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实验环境
实验室温度： 17-25℃ 实验室与饲养室温差：≤ 5 ℃ 实验温度变化： ≤ 3 ℃ 实验室：保持安静，避免强光、噪音等刺
激，注意实验兔之间相互影响。
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供试液配制
1、固体样品注意称量、稀释时的操作，避免 热 原和其它污染。
2、样品稀释时应注意准确性并尽量减少误差。 3、配制时应注意含量或效价(抗生素）的折算
问题以及总量是否够试验之用。 4、稀释用的灭菌注射用水及氯化钠注射液宜
经鲎试剂检查合格再用于稀释。
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新兔预选
1、新兔→饲养7日以上 2、预测体温（条件同热原检查）：测温
8次、间隔0.5小时。 3、中选条件：体温在38.0～39.6 ℃，
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实验动物
动物品系：均为远交系动物，普通级饲养。日本大 耳白（Japanese White），新西兰白（New Zealand White），青紫蓝，比利时白（Belgian White），Chinchillas 和 Dutch Belts
要求：健康合格、1.7～3.0kg、同一来源和品系。 性别:雌雄均可。雌性动物，比较温顺，易于捉持，
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热原检查（Pyrogen Test)
热原的含义 热原检查法基本原理 热原检查法基本操作 试验操作注意事项
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热原的含义
热原系指某些药品中含有的能引起体温升高 的杂质。
热原经静脉注入人体后15分钟即能产生强烈 的发热反应，重者昏迷甚至危及生命。
热原主要来源于革兰阴性菌的细菌内毒素。
计量设备（天平、公斤称等）
电热干燥箱（可达250℃以上） 恒温水浴（37～38 ℃） 家兔固定盒
热原测温仪或肛温计（测温探头或肛温计）
其它用品（7#针头、 12#针头、注射器、 直镊、配制容器、灭菌注射用水、氯化钠 注射液、酒精棉球等）
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Fra Baidu bibliotek
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实验准备
热原测温仪或肛温计定期校验，符合计 量认证的要求。 实验用具的除热原处理：试验用注射器、 针头及一切与供试品溶液接触的器皿， 洗涤，干燥， 250℃,30分钟以上。
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注射体积和注射速度
通常给药剂量 ≤10 ml/kg体重，并应在10 分钟内完成注射。一般情况下，注射的速 度和体积并不影响发热反应，大部分受试 溶液可以在1-2 min内注射完成，但部分受 试产品具有明显和迅速的药理作用，可影 响或干扰发热反应，需要缓慢进行注射
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热原剂量确定
实验的设计是基于在不超过10分钟的时间内，给 予家兔静脉注射使动物能够耐受的，不多于 10ml/kg体重剂量的受试药物。
《中国药品检验标准操作规程》2005版提出 “ 供试品的剂量应按各该药项下的规定注射， 未规定剂量的药品，可根据该药的药理性质，在 不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算（人 按50kg计），用临床一次剂量的3-10倍”
8次测温变化≤ 0.4 ℃（可供3周使用）
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实验兔重复使用
1、结果符合规定的实验兔，休息48hr 2、复试用兔升温＜0.6℃且供试品合格，休息48hr 3、使用次数未达10次的实验兔 4、复试用兔升温≥0.6℃且供试品合格，按新兔测温合
格
（以上实验兔可重复使用）
5、结果不符合规定的实验兔 6、使用次数达10次的实验兔
（以上实验兔不可再使用）
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家兔重复使用
美国药典27版仅仅规定了家兔使用频率， 并没有规定年龄限制和重复使用长度，使 用的频率规定不得超过每2天1次，若在热 原实验中最大升温0.6度或更高，以及热原 实验结果为阳性时，间隔时间不得小于2周。 动物重复使用的长度在很大程度上取决于 所检测的样品的性质，当家兔成熟时开始 进入热原实验，至少可使用2年
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热原检查法基本原理
被测物
试验 给药 动物 方法
测定设 备
判断标准
供试品溶液
（输液、小 针、粉针、 注射用原料）
家兔
耳静脉 注射
肛温计 给药后体
或
温变化
测温仪
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试验基本原理
家兔热原实验与人体的热原反应有什么样 联系？
1969年Greisman 和Hornick研究比较了三 种纯化内毒素对家兔和健康男性志愿者的 反应，结果表明：人和家兔产生热原反应 需要大约相同重量的细菌内毒素，但当热 原的剂量增加时，人体反应较家兔更为强 烈。