石蜡切片实验指导

组织石蜡切片技术

（编写者：艾鹏飞）

原理：以石蜡作为包埋剂，用旋（回）转切片机切成薄片，经脱水、染色、再脱水、通明、封片等处理制成永存切片，便于在显微镜下观察组织、细胞内的显微形态和结构。

药品与试剂：

福尔马林、二甲苯、石蜡、乙醇（50％、70％、80％、95％、100%）、蒸馏水、合成树脂、鲜蛋白、纯甘油、麝香草酚、冰醋酸、硫酸铝钾、碘酸钠、伊红Y、苏木精。

仪器及设备：

恒温水浴箱、金属包埋框（或玻璃平皿、硬纸折叠小盒等）、酒精灯、毛笔铅笔、小刀、持蜡器、擦布、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、玻璃棒、滴管、烧杯、无菌手术器械（包括眼科剪刀、眼科镊子、小脂肪夹）、2毫升注射器、显微镜、接物测微计、接目测微计。

1、取材：

组织块长1.0厘米，宽0.5厘米，厚0.5厘米，注明样本(根尖、叶片、花药、子房等)名称、编号。如用种子萌发的根尖，在根长至1-2厘米时，切取靠近根尖端部根茎约0.5厘米。

2、固定：

用FAA固定液（5%福尔马林+5%冰醋酸+90%的70%酒精）固定24h。

3、冲洗：

用70%酒精换洗3次，每次1-2h。

4、脱水：

80％、90％乙醇1—2h，再分别用无水乙醇（A）、（B）各脱水1—2h。

5、透明：

无水乙醇:二甲苯（1:1）透明1－2h，二甲苯（A）、（B）各透明1—2h。

6、透蜡：

买来的新蜡需经过煮炼方可使用，方法是：加温至60℃熔化，待凝固后再熔化，反复加温多次以除去石蜡内的水分，增加石蜡的密度，最后经过滤后使用。

依次用1:1、1:2二甲苯石蜡各浸泡15—20min（55℃），再分别用石蜡（A）、（B）各浸泡20—30min（60℃）。此过程在恒温水浴箱中进行。

7、包埋：

包埋，即将浸透石蜡的组织块铸成蜡块的过程。目的是增加组织的硬度，以便制成微薄的切片，其过程如下：

（1）将所用器械，包括金属包埋框（或是玻璃平皿，硬纸折叠小盒等），包埋用解剖镊等放入熔蜡箱内，烘热待用。

（2）将酒精灯点燃，从熔蜡箱中取出包埋框，于包埋框及其底板（通常用金属板或玻璃板）上涂一层液状石蜡或甘油，然后将熔化了的石蜡小心注入包埋器内。（3）用热镊子取出渗透石蜡的组织块，平置于包埋器内，注意将所需要的切面向上，平贴于包埋器的底部。

（4）将组织埋妥后及时将标本标记紧贴于所包组织的蜡块边缘，以免混乱。标记可用铅笔、毛笔书写，千万不可用钢笔或圆珠笔。

（5）当于室温下包埋器表层的石蜡凝固后，将包埋器平稳拿起，放入冷水中，以便包埋蜡块快速冷却凝固。注意一定要等表层石蜡凝固后再放，否则水浸入蜡块内，使蜡块内出现水泡，致包埋失败。

（6）包埋好的蜡块应进行修整，从包埋框取出蜡块，用小刀依照组织大小，切去边缘余蜡。注意蜡块四边均要平切，组织周围留下适度蜡边，底部平切，使成平整方块，其高度不宜超过1厘米，切忌损伤组织块。

（7）包埋好的蜡块应呈均匀的半透明状，若蜡块中组织出现混浊，则可能是由于组织脱水、透明不充分所致。若蜡块中出现白色冰花样结晶，则可能是由于包埋动作太慢，放入组织块时石蜡已出现部分凝固，或是包埋用石蜡中含有过多的二甲苯，还可能是冷却用水温度高，石蜡包埋完好后不能快速凝固而引起。

8、切片及粘片：

（1）将修整好的包埋组织蜡块固定于持蜡器上。

（2）准备好毛笔，盛蜡带的玻璃纸盒（或木盘），清洁机件和刀的擦布，眼科

镊子，小解剖刀及粘附刀片用的温水和“蛋白甘油”。

（3）从盒中取出切片刀，用布擦去油迹，必要时在显微镜下检查刀刃。将切片刀装上切片机持刀台。然后将预定使用的刀口移至蜡块胶块的下方。刀的倾角一般以4－6度为适当（倾角是指刀刃与蜡块平面所成的角）。如倾角过大则切片上卷，过小则切不成完整切片。

（4）固定好切片刀后，松开转轮固定器，使转轮缓慢下降至蜡块胶块稍离刀口为止，然后调整厚度指针（5－10微米）即可切片。

（5）石蜡切片的粘贴方法：

①展片台法：

展片前取干净载玻片滴“蛋白甘油”一滴于切片中央，用小指轻轻涂抹均匀，然后滴加蒸馏水1滴，用小镊子夹取切好的蜡片，使其浮于水面上，摆正位置后在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置于预先加热的展片台上（温度保持在40～45℃）。此时蜡片因受热而伸展摊平。放入温箱（37℃）一昼夜使其干燥，蜡片即可以粘牢。

②捞取法：

以器皿盛温水或用恒温水浴锅使温度保持约48℃左右，将蜡片摊于水面上，蜡片受热便自然打开，然后用涂有“甘油蛋白”的载片伸入水中，将蜡片移至玻片上，调整位置，倾区多余的水分后温箱干燥。

蛋白甘油的配制：

鲜蛋白30毫升，纯甘油30毫升，麝香草酚0.1—0.2克。

将鲜蛋白放入烧杯内，加入麝香草酚，然后用玻璃棒充分搅拌，再加入甘油继续搅拌，最后用粗滤纸或棉花过滤即可使用，此液放入冰箱可保存数月。

8、脱蜡复水：

石蜡切片经二甲苯（A）（B）脱蜡各5～10min，然后放入100%、95%、90%、80%、7%0等各级酒精溶液中各3～5min,再放入蒸馏水3min.

8、染色：

苏木精—伊红染色法（H.E染色法）：

（1）苏木精染液（Mayer苏木精染液改良法的配制）：

甲液—苏木精 1g

无水乙醇 50ml 冰醋酸 5ml 甘油 50ml 乙液—钾矾（硫酸铝钾） 5g

蒸馏水 50ml

后加碘酸钠 0.2g

配制时，苏木精溶于约15ml无水乙醇中，加冰醋酸后搅拌。当苏木精溶解后倒入甘油并摇动容器，同时加入其余的酒精（甲液）。钾矾在研钵中研碎后加热，然后将它溶解于水中（乙液）。将温热的乙液一滴一滴地加入到甲液中，并随时搅动。混合完毕后，加入0.2g碘酸钠，使其成熟。

（2）伊红染液（酒溶性伊红）：

伊红Y 1克

95％酒精 100毫升

冰醋酸 10滴

把伊红溶于酒精中，后加入冰醋酸一小滴。还可以加入少许麝香草酚以防腐。

（3）染色步骤：

苏木精染色：氧化苏木精染液染细胞核20～30min(20℃)。

自来水冲洗15min后，蒸馏水洗5分钟（冲洗过程中，镜检见切片颜色发蓝）。

伊红染色：苏木精染色水洗后，切片在50%、70%、80%、90%乙醇中各3～5min 后，伊红染细胞质2—5分钟。染色后再次脱水透明（步骤如下）：

脱水透明