单克隆抗体的制备PPT课件

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单克隆抗体的制备
广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇
一、单克隆抗体概念:
每一克隆B细胞所产生的理 化性状高度均一、组成均一、只 与同一种抗原决定族反应的抗体, 称为单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)。
二、杂交瘤技术制备单克隆抗体流程
动物免疫 分离脾细胞 制备骨髓瘤细胞
ELISA测血清 细胞融合 HAT培养基选择杂交瘤细胞 阳性孔克隆化并扩大培养 再次克隆
克隆扩大培养
扩大培养收集上清液
动物接种收集腹水
单克隆抗体纯化保存
三、单克隆抗体的基本技术 1.抗原提纯与动物免疫: 抗原纯度高:电泳纯 与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠 2.细胞的选择:
A 经过抗原免疫的B细胞(脾细胞)。 B 肿瘤细胞(多发性骨髓瘤细胞:Sp2/0)。 3.细胞融合: 融合剂:聚乙二醇 (PEG,常用聚合度1000~2000浓度w/v:40%) 细胞比例: 1:2~1:10,常用1:4。 反应时间:2~4min。
4.培养基的选择:HAT培养基。含有三种关键成 分 : 次 黄 嘌 呤 (hypoxanthine,H) 氨 甲 蝶 呤 (aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).
5.细胞的DNA合成一般有两条途径:
A:由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA, 叶酸作为重要的辅酶参与反应。
B:在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下,经次黄 嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷 激酶(TK)的催化下合成DNA。
6. HAT培养基的选择原理:
⑴ 氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂,可阻断细 胞利用正常途径合成DNA,细胞在含有 氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径 合成DNA。
⑵ 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞,自身不 能通过替代途径合成DNA而繁殖。
⑶ B细胞虽含有HGPRT,但不能在体外培 养存活(只存活5~7d,且功能下降)。
⑷ 融合细胞含有B细胞和瘤细胞,其中瘤 细 胞 核 利 用 B 细 胞 的 HGPRT 酶 进 行 旁 路 合成DNA而存活。
10.注意事项:
⑴ 用降植烷(pristane)等油类制剂,反复注入 BALB/C小鼠腹强腔,可诱发产生小鼠骨髓瘤细 胞。这种细胞在适宜培养条件下,具有无限繁 殖能力,选择本身不会产生Ig (SP2/O和小鼠骨 髓瘤653细胞株)的对数期生长细胞作为融合细 胞。
⑵选择缺乏HGPRT或TK的细胞:
A 采用毒性药物8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,8-AG) 选育出缺乏HGPRT的细胞(因为缺乏HGPRT+细 胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡,只有 HGPRT+ 细胞才能存活),培养过程中有个别 细胞出现返祖现象,故应定期用15~20ug/ml的 8-AG处理细胞。
B 或利用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, BudR)诱发缺乏TK的细胞。一般选育缺乏TK 的细胞较困难。
⑶采用饲养细胞:在体外培养条件下,单个或 少数分散的细胞不易顺利生长繁殖。当加入一 定量的其他活细胞后,常可促进原有细胞的繁 殖,这种加入的细胞即称为饲养细胞,可用普 通小鼠脾细胞/腹腔细胞/胸腺细胞、大鼠和豚 鼠的腹腔细胞,最常用普通小鼠腹腔细胞。
三、单克隆抗体的应用:
1.诊断(检测)试剂:病原体、肿瘤标志物、细胞 表面标志等
2.治疗:
A 移植物受者使用T细胞的McAb,可预防急性排 斥反应。
B 供体骨髓在体外经T细胞的McAb处理,可减轻 或消除移植物抗宿主反应。
C AIDS治疗
D 肿瘤介入治疗:细胞毒剂(药物)与抗肿瘤抗原 的McAb结合后,利用McAb的导向作用,将细 胞毒剂(药物)定位于肿瘤细胞,到达直接杀死 肿瘤细胞的目的。
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