【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种

样品的预处理

目的：提高分离效率 方法：


物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）； 离心法（浓缩） 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌

诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离

从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点
选择性
灵敏度
（3） 新种分离与筛选的步骤
调查研究（包括资料查阅）
试验方案设计
含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微 生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可 能性实现） 菌种分离


增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
比生长速率（ μ）与限制性基质浓度（S）有关。
(2) 分离筛选工作在实际中应用的几个方面


从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目 的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。
2.1 发酵工业菌种
2.1.5 未培养微生物

定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培 养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为 99％。 特点：广泛存在于各种自然环境中，尤其各种极端环境中，如高温、 低温、高压、高盐度、高辐射以及较强的酸碱环境。


研究方法： 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、单细胞操作 宏基因组分析法 ：是直接依据基因或基因组、蛋白质序列，以及 其调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用——获 得优良基因资源。
2.1 发酵工业菌种
2.1.2 酵母菌

特点：单细胞真核微生物，自然界普遍存在，主要分布于含糖较 多的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上以及果园土 壤中。 酿酒酵母 假丝酵母属 产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母 毕赤酵母属 、汉逊酵母属 （基因工程菌） 应用：用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及生产可 食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。
代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
本章内容
2.1 发酵工业菌种
2.2 发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 2.3 发酵工业菌种鉴定 2.4 发酵工业菌种改良 2.5 菌种保藏、复壮与扩培
本章重点：菌种来源，筛选原则与方法 ，菌种衰退，分离纯化 难 点：菌种保藏、复壮及扩大培养

2.1 发酵工业菌种
概述：

微生物在自然界中分布极为广泛，不断开发和利用微生物资源是人类社 会实现可持续发展的必由之路，也是解决现代社会经济高速发展所带来的 人口、资源、能源、环境、健康等问题的重要途径。 到目前为止，人类所知道的微生物种类不到总数的10%，而真正被利用 的还不到1%，进一步开发利用微生物资源的潜力很大。发酵工业广泛应 用于医药化工、食品轻工、农业、环保等诸多领域。 发酵工业应用的微生物种类：可培养微生物 + 未培养微生物 可培养微生物可分为四大类：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌，其中酵 母菌和丝状真菌为真核生物。
2.2.1 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （2） 菌种选择的要求（续）

菌种不易变异退化；
对放大设备的适应性强；
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性
物质和毒素。
2.2.2 符合发酵工业要求的菌种获得途径 （菌种来源） 从菌种保存机构直接购买所需菌株。中国菌种 保藏管理委员会（CCCCM）、美国典型菌种保 藏中心（ATCC）、英国国家典型菌种保藏所 （NCTC）、日本的大阪发酵研究所（IFO）等 ； 从自然界中筛选； 从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变的优 良菌种。
毛霉
链霉菌 啤酒酵母 假丝酵母
蛋白酶、糖化酶、 α -淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等
纤维素酶、蛋白酶等 转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等 脂肪酶、转化酶等
已工业化产品生产菌的介绍

问题：生产抗生素的微生物能不能用于 生产氨基酸？
理论上来说，微生物（包括动、植物细胞）几 乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到 工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定 的微生物才具有大量表达的潜力。
选择压力：在选择培养基中加入所需酶 的基质
随机分离原理与技术



从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。 技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。 随机分离技术举例 抗生素产生菌的筛选 药理活性化合物产生菌的筛选 生长因子产生菌的筛选 多糖产生菌的筛选


2.2.3 菌种分离筛选原理与技术
（1） 筛选的指导思想 （2） 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 （3） 新种分离筛选原理与技术
（1） 筛选的两种指导思想


先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。
来自百度文库
结果有两种可能： 获得适于工业发酵菌株
只获得选育所需的出发菌株
已工业化产品生产菌的介绍

抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的 代谢，目前发现的生物来源如下：
真菌（青霉素、头孢等）
放线菌（链霉素四环 素；红霉素等）
一些产芽孢的细菌
植物或 动物来 源
已工业化产品生产菌的介绍
氨基酸生产有关的微生物 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单 谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属、短杆菌属、 节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌其它氨基酸生产 菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成； 工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌
高产培养基设计的几个原则




制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物 阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。



2.1 发酵工业菌种
2.1.1 细菌


特点：单细胞原核微生物，自然界分布最广，数量最多，与人类 生产和生活关系十分密切。 应用： 醋酸杆菌 （——醋） 乳酸杆菌 （双歧杆菌、瑞士乳杆菌——酸奶） 芽孢杆菌 （枯草芽孢杆菌——豆豉；纳豆芽孢杆菌——纳豆） 丙酮丁醇梭菌 （——有机酸） 大肠杆菌 （构建工程菌——核酸与蛋白质疫苗） 谷氨酸棒状杆菌 （——味精）
2.1 发酵工业菌种
2.1.4 放线菌

特点：介于细菌和真菌之间的单细胞微生物；原核生物类群，自 然界分布广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较广，大 多腐生，少数寄生。 链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌 应用：最大经济价值在于能产生多种抗生素，如链霉素、红霉 素、金霉素、庆大霉素等。从微生物中发现的抗生素有60%以 上由放线菌产生。
2.1 发酵工业菌种
2.1.3 霉菌

特点：“发霉的真菌”，自然界分布广泛，大量存在于土壤、空 气、水和生物体中，喜欢偏酸性环境。 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉 应用：可广泛应用于生产酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
2.2 发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术 2.2.1 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 2.2.2 符合发酵工业要求的菌种获得途径 2.2.3 分离筛选原理与技术 2.2.4 应用举例
2.2 发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
2.2.1 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （1） 菌种选择的总趋势

抗生素产生菌的筛选

筛选模型：试验菌 筛选方法： 固体培养筛选 液体培养筛选
铺菌法 影印平板法
抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β -内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同 I II 无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
试验菌 金黄色葡萄球菌209p
常见菌种及其产物列表
微生物类 群 细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 菌种 代谢产物
枯草杆菌、大肠杆 有机酸、氨基酸、核苷酸、酶、 菌、短杆菌等 维生素、醇类、抗生素等 链霉菌属等 抗生素、维生素、酶、甾体转 化等
酿酒酵母，酒精酵 单细胞蛋白、核苷酸、核黄素、 母 细胞色素C等 曲霉属，红曲霉属， 乙醇、有机酸、抗生素、酶、 根霉属，青霉属等 维生素等
A
μ
B
S0
基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
当S<S0时，富集什么菌株？
当S>S0时，富集什么菌株？
连续富集培养技术分离菌株的优点

分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
B. 固体培养技术

常用于分离某些酶产生菌

酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等 糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等 葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核 酸酶等 纤维素酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果 胶酶、纤维素酶等
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
2.2.1 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （2） 菌种选择的要求

能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成
的目的产物产量高、易于回收；

生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；


培养条件易于控制；
抗噬菌体及杂菌污染的能力强；

已工业化产品生产菌的介绍
食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关 于食品用酶，美国需要得到FDA的批准，目前已同意使用的 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 目前大多数的工业微生物酶的生产都局限于使用仅有 的11种真菌、8种细菌和4种酵母菌。 α-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌 和地衣芽孢杆菌。
根据目的菌株及其产物特点分
选择性分离方法
(定向筛选←选择压力)
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）
富集液体培养 (初筛)
固体培养基条件培养
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛
生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和
或作为育种的出发菌株
毒性试验等
含微生物样品的采集
选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术


生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件 选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
A.富集液体培养

采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布（耕地、菜园和近郊土壤——细菌和放线菌；
山坡上的森林土壤——霉菌和酵母菌）

采土深度 （5-25CM土层适宜） 土壤植被情况 （葡萄根部附近土壤——酵母菌） 采样季节 土壤的酸碱度（偏碱——细菌和放线菌；偏酸——霉菌和酵母菌 ） 对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌 种