红肉火龙果果皮色素的分离_纯化和HPLC_MS分析
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－1 1000 － 4000 cm － 1 下对火龙果果皮材料进行红外光谱检测 ， 研究色素的结构组成， 光谱分辨率为 4 cm ．
1．4．3 1．4．4
HPLC 分析
4 － 6］ ， 1．0% 三氟乙酸和水溶 参考文献［ 确定高效液相试验中的流动相为甲醇 、 乙腈、 以火龙果果皮色素纯化液为材料， 采用液相色谱—质谱联用技术 （ HPLC / MS ） 对
· 590· 1． 4 1．4．1 方法 火龙果色素的初步纯化
福建农林大学学报（ 自然科学版）
第 42 卷
以火龙果果皮冻干粉为原料， 提取条件为浸提温度 30 ℃ ， 浸提时间 45
min， 提取剂 pH 值为 6．5 ， 乙醇体积分数 40% ． 取一定的色素提取液， 加入 2 倍体积的乙醚溶液充分振荡、 静置， 等混合液完全分层后， 收集下层的溶 18 固 液， 再用乙醚溶液萃取 2 次， 得到除去脂质、 脂溶性色素、 黄酮、 简单酚类的下层溶液， 备用． 将 ODSC相吸附柱先经甲醇激活， 然后用 0．01% （ 体积分数） 的 HCl 溶液平衡． 加入一定量的经乙醚萃取过的色素 提取液， 使色素吸附在柱上； 然后用 5 倍体积的 0． 01% 的 HCl 溶液将糖、 酸等水溶性物质洗下； 再用乙酸 将洗脱液在 35 ℃ 下真空 乙酯洗脱出低含量的多酚和低相对聚合度的单宁 ； 再经 0．01% 盐酸—甲酸洗脱， 浓缩， 去除甲醇， 浓缩液以 0．01% 的 HCl 溶液稀释定容， 得到火龙果果皮色素纯化液． 1．4．2 红外光谱分析 采用溴化钾压片法制备红外光谱分析材料． 取纯化的火龙果果皮色素粉末 1 － 2 mg， 置于预热过的玛瑙研钵中， 预热一段时间后， 称取约 200 mg 纯溴化钾粉末与之混合， 在红外灯下研磨 粒度小于 2 μm； 取出若干置于模具中， 以约 30 MPa 压力在油压机上压成透明薄片， 上样； 在 成均匀细末，
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－1 液， 流速为 1 mL·min ， 柱温为 25 ℃ ， 进样量 20 μL．
HPLCMS 分析
并测定红肉火龙果果皮色素各组成成分的含量 ． 其进行定性分析，
2
2． 1
结果与分析
红外光谱分析结果
－1 －1 （ 1 ） 从图 1 可看出， 火龙果果皮色素提取物在 3404 cm 处有特征吸收峰． 3400 － 3600 cm 是 O － H ［7 ］
收稿日期： 2013 － 09 － 04 修回日期： 2013 － 10 － 20 基金项目： 福建省科技厅重大资助项目 （ 2010N3006 ） ． 博士 女， 副教授． 研究方向： 园艺植物栽培技术． Email： yyf1126@ 126． com． 通讯作者陈清西 （ 1964 － ） ， 男， 教授， 作者简介： 袁亚芳（ 1963 － ） ， 生导师． 研究方向： 园艺植物栽培生理 ． Email： cqx0246@ 163． com．
红肉火龙果果皮色素的分离 、 纯化和 HPLC-MS 分析
1 2 2 2 1 袁亚芳 ，赵珍珍 ，王 威 ，陈清西 ，余志雄 （ 1． 福建农业职业技术学院， 福建 福州 350119 ； 2． 福建农林大学园艺学院， 福建 福州 350002 ）
摘要： 采用红外吸收光谱分析技术以及液相色谱 － 质谱联用技术， 对提取、 纯化得到的火龙果果皮红色素进行官能团 、 组分 O及结构分析． 结果表明： 火龙果果皮红色素均为甜菜苷 ； 共得到 6 种组分的甜菜苷， 以 5β葡萄糖 － 甜菜苷为主要成分． MS 关键词： 火龙果； 色素； 提取； 纯化； HPLC中图分类号： S667．9 文献标识码： A 5470 （ 2013 ） 06058904 文章编号： 1671-
Separation，purification and HPLCMS analysis of the peel pigments of red pulp pitaya
YUAN Yafang1 ，ZHAO Zhenzhen2 ，WANG Wei2 ，CHEN Qingxi2 ，YU Zhixiong1
供试材料 （ Hylocereus 本试验所用火龙果由国信星火 （ 漳州 ） 红龙果开发有限公司提供， 供试品种为‘红仙蜜 ’
undatus ‘Hong Xian Mi’ ， 红肉火龙果） ， 无病虫害的果实， 以蒸馏水冲洗干净， 去果肉 九成熟． 选择无畸形、 取皮， 用真空干燥． 干燥后的果皮用多功能粉碎机研磨成粉末 ， 过 40 目筛， 于 － 40 ℃ 冰箱保存备用． 1． 2 1． 3 试剂 主要有盐酸、 氢氧化钠、 无水乙醇、 乙醚、 乙酸乙酯和甲醇（ 色谱纯） ． 试验流程 火龙果清洗、 晾干→果皮、 果肉分离→ 切碎果皮 → － 40 ℃ 低温冷冻 → 冻干机冻干 → 粉碎 机粉碎， 过 40 目→取粉末， 加入提取剂提取→离心→旋转、 蒸发回收乙醇 →色素提取 →色素的 18 固相萃取小柱进行分离纯化 → 得到火龙果果皮色素纯化液 → 冻干机冻 初步纯化→采用 ODSCHPLCMS 分析． 干成粉末→红外光谱分析、 液相 HPLC 分析、
－1 由此可推测火龙果果皮色素中有饱和 C － H 键存在． 在 2930．40 cm 处各有 1 个吸收峰， －1 ［9 ， 10 ］ （ 3 ） 图 1 显示， ， 该火龙果果皮色素提取物在 1607．07 cm 处有明显的吸收峰． 据文献 芳环或杂环 －1 1580 及 1450 cm － 1 附近有尖锐的特征吸收峰， 吸收峰会在 1420 － 1620 cm 振动， 芳环一般在 1600 、 其强度
图2
Fig． 2
火龙果果皮色素高效液相色谱图
HPLC spectra of the peel pigment of pitaya
a． 保留时间 11．8 min； b． 保留时间 14．8 min； c． 保留时间 21．8 min； d． 保留时间 22．1 min； e． 保留时间 24．8 min．
［8 ］ －1 2 种 C － O 振动伸缩引起的， CH3 － 在 即 C － O － C 和 C － O － H ． 2800 － 3000 cm 为 C － H 键吸收峰，
（ 2872 ± 10 ） cm － 1 － （ 2962 ± 10 ） cm － 1 会出现相距约 80 cm － 1 的双峰［7］． 从图 1 可看出， 该火龙果果皮色素
［4 ］
提出火龙果色素为花色苷与原
火龙果果皮、 果肉色素都为甜菜苷类色素， 并从果肉中分离出 4 种组 研究表明， 对红龙果果肉红色素进行分离， 鉴定出 10 种化合物， 主要为甜菜
红苷． 本文拟通过红外吸收光谱技术， 结合液相色谱 － 质谱联用技术， 分析火龙果果皮红色素的化学成分 ，
1
1． 1
材料与方法
C － O － H 键、 C 综上分析表明， 火龙果果皮色素物质内存在 C － O － C 键、 饱和 C － H 键、 芳环或杂环、
第6 期
MS 分析 袁亚芳等： 红肉火龙果果皮色素的分离 、 纯化和 HPLC-
· 591·
－ O 键等． 2．2 HPLC、 HPLCMS 分析结果
［13 ］
根据文献 中最佳高效液相的流动相和保留 时间， 得到高效液相色谱图． 对火龙果进行高效液相 试验分析， 在 538 nm 检测波长下得到的 HPLC 色谱 图如图 2 所示． 由图 2 可知， 火龙果果皮色素中各种成分均得 到了较好的分离． 各色谱峰的具体成分根据 HPLCMS 数据进行进一步分析． 按照优化的液相色谱条件 和质谱检测条件对红龙果红色素样品进行测定分 析， 得到正总离子流图（ 图 3 ） ．
火龙果（ Hylocereus undatus） 为仙人掌科 （ Cactaceae） 植物， 又名仙蜜果、 红龙果等． 火龙果果肉富含糖、 有机酸、 蛋白质、 氨基酸、 维生素、 矿质元素及膳食纤维 花色苷素． 而刘小玲等
［3 ］ ［1 ］
， 还含有丰富的天然红色素． 目前对火龙果的研
［2 ］
究主要集中在营养成分的分析， 有关火龙果色素的研究较少． 张伟峰等 分， 从果皮中分离出 2 种组分． 烟利亚 为火龙果综合开发利用提供依据 ．
图3
Fig． 3
火龙果果皮色素 MS 图
The MS chromatograms of the peel pigment of pitaya
经液相分离及液质联用分析， 从果皮中得到 6 种组分． 根据文献报道， 在检测波长为 538 nm 下， 出现 质荷比为 551 的离子峰， 推测这个组分相对分子质量为 550 ， 且这一组分在 11．8 min 和 14．8 min 均有出现 （ 图 3a、 OO图 3b） ， 可推测这 2 种组分为同分异构体， 为 5β葡萄糖—甜菜苷结构式和 5β葡萄糖—甜菜 ［5 ］ 图 3d ） ， 可推测其甜菜苷色素类型为 苷 ； 21．8 min 与 22． 1 min 均出现质荷比为 637 的离子峰 （ 图 3c、 ［3 ］ phyllocactin ； 24．8 min 时出现质荷比为 507 、 695 的离子峰（ 图 3e） ， 最大吸收波长为 538 nm， 推测其分别 155O－ 、 － （ 1 ） ． 脱羧 β 葡萄糖 甜菜苷 戊酰 β 葡萄糖 甜菜苷 表 为
键伸缩振动出现的吸收峰， 说明该火龙果果皮色素中均含有 O － H 结构
．
图1
Fig． 1
火龙果果皮色素提取物的红外吸收光谱图
Infrared spectrum of natural red pigments from pitaya peel
（ 2 ） 红外光谱中， 3200 － 3600 cm － 1 为 N － H 和 O － H 的伸缩振动吸收峰， 950 － 1200 cm － 1 的吸收峰是
· 592·
福建农林大学学报（ 自然科学版） 表1
Table 1
第 42 卷
火龙果果皮色素的质谱数据
保留时间 / min 11．580 14．856 21．552 22．938 23．423 24．736 检测波长 / nm 538 538 538 538 538 538 质荷比 551 551 637 637 507 695
（ 1． Fujian Vocational College of Agriculture，Fuzhou，Fujian 350119 ，China； 2． College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002 ，China） Abstract ： The techniques of infrared absorption spectroscopy and HPLCMS were used for the analysis of functional group， composition and structure of extracted and purified pitaya peel red pigments． The results showed that pitaya peel red pigments were glycosides，and 6 kinds of components of beet glycosides were obtained， 5Oglucosebetanin was main glycosides． βKey words： pitaya； pigment； extraction； purification； HPLCMS
由此可判断火龙果果皮色素中有芳环或杂环存在 ． 随取代基团的不同而不同，
－1 －1 （ 4 ） 图 1 显示， 该火龙果果皮色素提取物在 1000 － 1300 cm 均有吸收峰． 指纹区 （ 650 － 1300 cm ） －1 C － O 键的伸缩振动在 1000 － 1300 分为 2 个区域， 其中 910 － 1300 cm 区域是所有单键伸缩变形振动区 ， 12 ］ cm － 1 显示吸收［11， ， 可以判断火龙果果皮色素中有 C － O 键存在．
1．4．3 1．4．4
HPLC 分析
4 － 6］ ， 1．0% 三氟乙酸和水溶 参考文献［ 确定高效液相试验中的流动相为甲醇 、 乙腈、 以火龙果果皮色素纯化液为材料， 采用液相色谱—质谱联用技术 （ HPLC / MS ） 对
· 590· 1． 4 1．4．1 方法 火龙果色素的初步纯化
福建农林大学学报（ 自然科学版）
第 42 卷
以火龙果果皮冻干粉为原料， 提取条件为浸提温度 30 ℃ ， 浸提时间 45
min， 提取剂 pH 值为 6．5 ， 乙醇体积分数 40% ． 取一定的色素提取液， 加入 2 倍体积的乙醚溶液充分振荡、 静置， 等混合液完全分层后， 收集下层的溶 18 固 液， 再用乙醚溶液萃取 2 次， 得到除去脂质、 脂溶性色素、 黄酮、 简单酚类的下层溶液， 备用． 将 ODSC相吸附柱先经甲醇激活， 然后用 0．01% （ 体积分数） 的 HCl 溶液平衡． 加入一定量的经乙醚萃取过的色素 提取液， 使色素吸附在柱上； 然后用 5 倍体积的 0． 01% 的 HCl 溶液将糖、 酸等水溶性物质洗下； 再用乙酸 将洗脱液在 35 ℃ 下真空 乙酯洗脱出低含量的多酚和低相对聚合度的单宁 ； 再经 0．01% 盐酸—甲酸洗脱， 浓缩， 去除甲醇， 浓缩液以 0．01% 的 HCl 溶液稀释定容， 得到火龙果果皮色素纯化液． 1．4．2 红外光谱分析 采用溴化钾压片法制备红外光谱分析材料． 取纯化的火龙果果皮色素粉末 1 － 2 mg， 置于预热过的玛瑙研钵中， 预热一段时间后， 称取约 200 mg 纯溴化钾粉末与之混合， 在红外灯下研磨 粒度小于 2 μm； 取出若干置于模具中， 以约 30 MPa 压力在油压机上压成透明薄片， 上样； 在 成均匀细末，
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－1 液， 流速为 1 mL·min ， 柱温为 25 ℃ ， 进样量 20 μL．
HPLCMS 分析
并测定红肉火龙果果皮色素各组成成分的含量 ． 其进行定性分析，
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2． 1
结果与分析
红外光谱分析结果
－1 －1 （ 1 ） 从图 1 可看出， 火龙果果皮色素提取物在 3404 cm 处有特征吸收峰． 3400 － 3600 cm 是 O － H ［7 ］
收稿日期： 2013 － 09 － 04 修回日期： 2013 － 10 － 20 基金项目： 福建省科技厅重大资助项目 （ 2010N3006 ） ． 博士 女， 副教授． 研究方向： 园艺植物栽培技术． Email： yyf1126@ 126． com． 通讯作者陈清西 （ 1964 － ） ， 男， 教授， 作者简介： 袁亚芳（ 1963 － ） ， 生导师． 研究方向： 园艺植物栽培生理 ． Email： cqx0246@ 163． com．
红肉火龙果果皮色素的分离 、 纯化和 HPLC-MS 分析
1 2 2 2 1 袁亚芳 ，赵珍珍 ，王 威 ，陈清西 ，余志雄 （ 1． 福建农业职业技术学院， 福建 福州 350119 ； 2． 福建农林大学园艺学院， 福建 福州 350002 ）
摘要： 采用红外吸收光谱分析技术以及液相色谱 － 质谱联用技术， 对提取、 纯化得到的火龙果果皮红色素进行官能团 、 组分 O及结构分析． 结果表明： 火龙果果皮红色素均为甜菜苷 ； 共得到 6 种组分的甜菜苷， 以 5β葡萄糖 － 甜菜苷为主要成分． MS 关键词： 火龙果； 色素； 提取； 纯化； HPLC中图分类号： S667．9 文献标识码： A 5470 （ 2013 ） 06058904 文章编号： 1671-
Separation，purification and HPLCMS analysis of the peel pigments of red pulp pitaya
YUAN Yafang1 ，ZHAO Zhenzhen2 ，WANG Wei2 ，CHEN Qingxi2 ，YU Zhixiong1
供试材料 （ Hylocereus 本试验所用火龙果由国信星火 （ 漳州 ） 红龙果开发有限公司提供， 供试品种为‘红仙蜜 ’
undatus ‘Hong Xian Mi’ ， 红肉火龙果） ， 无病虫害的果实， 以蒸馏水冲洗干净， 去果肉 九成熟． 选择无畸形、 取皮， 用真空干燥． 干燥后的果皮用多功能粉碎机研磨成粉末 ， 过 40 目筛， 于 － 40 ℃ 冰箱保存备用． 1． 2 1． 3 试剂 主要有盐酸、 氢氧化钠、 无水乙醇、 乙醚、 乙酸乙酯和甲醇（ 色谱纯） ． 试验流程 火龙果清洗、 晾干→果皮、 果肉分离→ 切碎果皮 → － 40 ℃ 低温冷冻 → 冻干机冻干 → 粉碎 机粉碎， 过 40 目→取粉末， 加入提取剂提取→离心→旋转、 蒸发回收乙醇 →色素提取 →色素的 18 固相萃取小柱进行分离纯化 → 得到火龙果果皮色素纯化液 → 冻干机冻 初步纯化→采用 ODSCHPLCMS 分析． 干成粉末→红外光谱分析、 液相 HPLC 分析、
－1 由此可推测火龙果果皮色素中有饱和 C － H 键存在． 在 2930．40 cm 处各有 1 个吸收峰， －1 ［9 ， 10 ］ （ 3 ） 图 1 显示， ， 该火龙果果皮色素提取物在 1607．07 cm 处有明显的吸收峰． 据文献 芳环或杂环 －1 1580 及 1450 cm － 1 附近有尖锐的特征吸收峰， 吸收峰会在 1420 － 1620 cm 振动， 芳环一般在 1600 、 其强度
图2
Fig． 2
火龙果果皮色素高效液相色谱图
HPLC spectra of the peel pigment of pitaya
a． 保留时间 11．8 min； b． 保留时间 14．8 min； c． 保留时间 21．8 min； d． 保留时间 22．1 min； e． 保留时间 24．8 min．
［8 ］ －1 2 种 C － O 振动伸缩引起的， CH3 － 在 即 C － O － C 和 C － O － H ． 2800 － 3000 cm 为 C － H 键吸收峰，
（ 2872 ± 10 ） cm － 1 － （ 2962 ± 10 ） cm － 1 会出现相距约 80 cm － 1 的双峰［7］． 从图 1 可看出， 该火龙果果皮色素
［4 ］
提出火龙果色素为花色苷与原
火龙果果皮、 果肉色素都为甜菜苷类色素， 并从果肉中分离出 4 种组 研究表明， 对红龙果果肉红色素进行分离， 鉴定出 10 种化合物， 主要为甜菜
红苷． 本文拟通过红外吸收光谱技术， 结合液相色谱 － 质谱联用技术， 分析火龙果果皮红色素的化学成分 ，
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1． 1
材料与方法
C － O － H 键、 C 综上分析表明， 火龙果果皮色素物质内存在 C － O － C 键、 饱和 C － H 键、 芳环或杂环、
第6 期
MS 分析 袁亚芳等： 红肉火龙果果皮色素的分离 、 纯化和 HPLC-
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－ O 键等． 2．2 HPLC、 HPLCMS 分析结果
［13 ］
根据文献 中最佳高效液相的流动相和保留 时间， 得到高效液相色谱图． 对火龙果进行高效液相 试验分析， 在 538 nm 检测波长下得到的 HPLC 色谱 图如图 2 所示． 由图 2 可知， 火龙果果皮色素中各种成分均得 到了较好的分离． 各色谱峰的具体成分根据 HPLCMS 数据进行进一步分析． 按照优化的液相色谱条件 和质谱检测条件对红龙果红色素样品进行测定分 析， 得到正总离子流图（ 图 3 ） ．
火龙果（ Hylocereus undatus） 为仙人掌科 （ Cactaceae） 植物， 又名仙蜜果、 红龙果等． 火龙果果肉富含糖、 有机酸、 蛋白质、 氨基酸、 维生素、 矿质元素及膳食纤维 花色苷素． 而刘小玲等
［3 ］ ［1 ］
， 还含有丰富的天然红色素． 目前对火龙果的研
［2 ］
究主要集中在营养成分的分析， 有关火龙果色素的研究较少． 张伟峰等 分， 从果皮中分离出 2 种组分． 烟利亚 为火龙果综合开发利用提供依据 ．
图3
Fig． 3
火龙果果皮色素 MS 图
The MS chromatograms of the peel pigment of pitaya
经液相分离及液质联用分析， 从果皮中得到 6 种组分． 根据文献报道， 在检测波长为 538 nm 下， 出现 质荷比为 551 的离子峰， 推测这个组分相对分子质量为 550 ， 且这一组分在 11．8 min 和 14．8 min 均有出现 （ 图 3a、 OO图 3b） ， 可推测这 2 种组分为同分异构体， 为 5β葡萄糖—甜菜苷结构式和 5β葡萄糖—甜菜 ［5 ］ 图 3d ） ， 可推测其甜菜苷色素类型为 苷 ； 21．8 min 与 22． 1 min 均出现质荷比为 637 的离子峰 （ 图 3c、 ［3 ］ phyllocactin ； 24．8 min 时出现质荷比为 507 、 695 的离子峰（ 图 3e） ， 最大吸收波长为 538 nm， 推测其分别 155O－ 、 － （ 1 ） ． 脱羧 β 葡萄糖 甜菜苷 戊酰 β 葡萄糖 甜菜苷 表 为
键伸缩振动出现的吸收峰， 说明该火龙果果皮色素中均含有 O － H 结构
．
图1
Fig． 1
火龙果果皮色素提取物的红外吸收光谱图
Infrared spectrum of natural red pigments from pitaya peel
（ 2 ） 红外光谱中， 3200 － 3600 cm － 1 为 N － H 和 O － H 的伸缩振动吸收峰， 950 － 1200 cm － 1 的吸收峰是
· 592·
福建农林大学学报（ 自然科学版） 表1
Table 1
第 42 卷
火龙果果皮色素的质谱数据
保留时间 / min 11．580 14．856 21．552 22．938 23．423 24．736 检测波长 / nm 538 538 538 538 538 538 质荷比 551 551 637 637 507 695
（ 1． Fujian Vocational College of Agriculture，Fuzhou，Fujian 350119 ，China； 2． College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002 ，China） Abstract ： The techniques of infrared absorption spectroscopy and HPLCMS were used for the analysis of functional group， composition and structure of extracted and purified pitaya peel red pigments． The results showed that pitaya peel red pigments were glycosides，and 6 kinds of components of beet glycosides were obtained， 5Oglucosebetanin was main glycosides． βKey words： pitaya； pigment； extraction； purification； HPLCMS
由此可判断火龙果果皮色素中有芳环或杂环存在 ． 随取代基团的不同而不同，
－1 －1 （ 4 ） 图 1 显示， 该火龙果果皮色素提取物在 1000 － 1300 cm 均有吸收峰． 指纹区 （ 650 － 1300 cm ） －1 C － O 键的伸缩振动在 1000 － 1300 分为 2 个区域， 其中 910 － 1300 cm 区域是所有单键伸缩变形振动区 ， 12 ］ cm － 1 显示吸收［11， ， 可以判断火龙果果皮色素中有 C － O 键存在．