生物反应器生产狂犬病疫苗的工艺应用

生物反应器生产狂犬病疫苗的工艺应用

作者：张瑜

来源：《兽医导刊》 2016年第3期

狂犬病是一种致死率非常高的人畜共患病，我国列为甲类传染病，是重要防控疫病。由于

尚无非常有效的治疗方法，因此暴露于该病原后，接种疫苗是最重要预防措施之一。2015 年OIE 的狂犬病控制计划指出，95% 的人狂犬病是由病犬咬伤所致，如果实现70% 以上的犬免疫，可将人的狂犬病发病率极大降低。与人预防该病相比，所消耗的费用成本节约近10 倍。此外

加强狗和野生动物狼等易感动物免疫是逐渐净化本病的根本方法。

自从1885 年，Louis Pasteur首次用兔脑和脊髓制备了狂犬病弱毒疫苗，成功保护了第一位狂犬病野毒暴露者。此后，在疫苗安全性和免疫效果方面不断改进和提高。狂犬病疫苗经历

了神经组织疫苗，禽胚疫苗，细胞培养疫苗的发展历程。

一、狂犬病疫苗毒株及培养基质

1. 狂犬病疫苗的发展。最早的狂犬病疫苗是用感染疫苗毒株的动物脑和脊髓神经组织制备而成。由于其效价低，免疫产生抗体水平较差，且含有大量神经髓磷脂，存在引发变态反应等

缺点。此后，开发出禽胚组织培养狂犬病疫苗。1955年，Peck 制备了鸭胚疫苗（DEV）。虽然

鸭胚疫苗在生产工艺又有进一步改善，引起变态反应的危险性降低，但仍然表现出免疫后抗体

效价低的特点。第三代疫苗走上历史舞台，将狂犬病病毒适应于细胞培养，生产细胞培养狂犬

病疫苗，主要包括原代细胞疫苗、二倍体细胞疫苗和传代细胞疫苗。随着生产工艺改进，第三

代疫苗免疫效果好，副反应少，能够实现大批量生产，肩负起了目前免疫防控狂犬病的重任。

虽然，狂犬病基因工程疫苗也进行很多研究，包括重组活载体疫苗、亚单位疫苗和基因疫苗等。

2. 狂犬病疫苗毒株。由于狂犬病分布广泛，各个国家和地区依据本国疫情流行情况，培养筛选出不同的狂犬疫苗毒株。应用最为广泛的毒株来源于3 个疫苗株：1882 年从狂犬病病犬

脊髓分离并通过兔体传代的固定毒巴斯德株(Paris-Pasteur株) ；1939 年从美国一个患病女

孩脊髓悬液经鼠脑传代分离，以鸡胚传代的固定毒Flury 株；1935 年美国一个患病犬体内分

离的SAD 株，经鼠脑传代固定毒SAD 株。SAD 株是弱毒疫苗株，经过分离筛选出的SAD Bern, SAG2, 和SAD B19 等毒株，生产弱毒口服疫苗，在欧洲广泛用于野生动物的免疫，取得了明显

的疫病防控效果。为了排除口服弱毒疫苗SAD 株免疫动物后毒力返强的可能性，进行了现有弱

毒株基因重组，以用于更换现有的口服弱毒疫苗株。

3. 狂犬病疫苗培养基质。原代细胞培养相对简单，能够用于较多狂犬病毒株培养。狂犬病毒SAD 株、Paris-Pasteur 株和aGT 株适应原代地鼠肾细胞培养，Flury-LEP 株及Flury-HEP 在鸡胚成纤维细胞上培养，生产出弱毒疫苗和灭活疫苗，广泛用于人和动物的狂犬病预防免疫。原代细胞质量有批间差异，存在潜在的病毒等外源因子污染等缺点，应用变少。

二倍体细胞与原代细胞相比，具有能够充分鉴定和标准化的优点，可实现细胞种子库系统，建立的细胞库可多年用于生产，有利于质量控制。但其对培养条件要求较为苛刻，生产成本也

较高，价格昂贵，兽用疫苗应用较少。传代细胞与二倍体细胞优点相似，但其易于培养，而得

到较为广泛应用。1962 年，日本千叶大学学者分离培养出非洲绿猴肾细胞（Vero），适用于

狂犬病毒株CTN、aG 和PM 株的灭活疫苗生产，用于狂犬病预防。我国于1995 年开始进行人

用纯化Vero 细胞狂犬病疫苗的研制，已有多家生物制品公司获得了生产文号。1961 年，

A.Macpherson 和M.G..P.Stoker从1 日龄仓鼠分离出幼仓鼠肾细胞（BHK），并培养成为细胞系。BHK细胞对狂犬病病毒敏感性高，增殖培养PM 株、ERA 株SAD 株及CTN-181 株等毒株。

法国维克用BHK-21 细胞培养（VP12 株）生产的犬、猫用狂犬病疫苗，获得了在法国生产文

号，并在我国进行了注册。在国内，BHK-21 传代细胞培养HEP-Flury 株生产灭活疫苗，经过

安全性和免疫效力检验合格，NIH 检验达到2IU。

二、生物反应器细胞培养狂犬病疫苗工艺应用

1962 年，Capstile 成功完成BHK-21 细胞大规模悬浮培养。1967 年，Van Wezel 首先开

创了微载体细胞培养技术，标志生物反应器培养动物细胞技术的起步。经过几十年的发展，其

已广泛用于疫苗生产领域，因其具有节约生产所需的空间，生产过程易于监控，实现自动化、

规模化生产，降低批次产品间差异的优点。生物反应器生产疫苗工艺正在被广泛接受。

狂犬病疫苗生产用细胞为贴壁依赖性，包括原代细胞、二倍体细胞和传代细胞，适用于生

物反应器微载体培养。培养类型分为微载体悬浮培养和固定床微载体培养。微载体悬浮培养工

艺采用搅拌桨式生物反应器，能够悬浮的球状载体。依据病毒株和细胞的培养特点，优化狂犬

病疫苗生产工艺，通过对反应器物理结构等比例放大，应用于生产。1984 年，法国Merieun

研究所在微载体悬浮培养的Vero 细胞上繁殖狂犬病毒PM1503-3M 株，制备出纯化Vero 细胞

狂犬病疫苗（PurifiedVero Rabies Vaccine, PVRV）。该苗免疫原性好、安全、稳定，可大规模生产，产量高，价格便宜，WHO推荐使用Vero 细胞大量生产狂犬疫苗。搅拌桨生物反应器培养BHK-21 细胞，接入狂犬病PV 株种毒，培养出高滴度病毒抗原液，便于下游纯化工艺，制

备出低成本，免疫效果好的疫苗。Cytodex1 微载体悬浮培养Vero 细胞，与常规含血清培养液

相比，无动物成分培养液更适于Vero 细胞生长，得到更高效价抗原液。该工艺的开发，将简

化下游工艺，降低疫苗副反应。

固定床微载体细胞培养生物反应器突破原有技术瓶颈，逐渐扩大应用范围。固定床微载体

多采用具有一定结构的聚酯纤维载体例如Fibra-Cel disks 和BioNOC II Matrix。有实验发现，与Cytodex1 载体悬浮培养相比，固定床载体Fibra-Celdisks 的培养的细胞密度更高，单位

细胞产能，病毒产毒量均有提高。固定床生物反应器一般具有较低细胞剪切力，独特的暴气方

式和传质效率等特点，形成特有的培养体系。与搅拌桨反应器相比，iCELLis 固定床生物反应

器更适于MRC-5 细胞培养。固定床反应器的载体为大孔微载体，存在生物反应器逐级放大和大

体积培养的工艺瓶颈，因此更适于致细胞病变弱的狂犬病毒株的生产。

狂犬病仍是我国需要防控的致死率高的烈性传染病，而被患病犬咬伤是主要根源，因此应

加强与人类接触频繁的宠物犬和流浪犬等免疫。随着国家对易感动物强制接种的力度不断加大

和未来启动净化本病，对狂犬疫苗灭活疫苗和口服弱毒疫苗的需求也会日益增加。结合我国狂

犬病兽用疫苗株和细胞特点，选用合适生物反应器建立疫苗抗原生产工艺，生产出价格低的优

质病毒抗原液。为保证产品具有稳定免疫效力，较高的安全性和最低副反应，生产企业应对狂

犬病疫苗下游浓缩，纯化和配苗佐剂的工艺进一步开发，以提供充足有效的狂犬病疫苗。

参考文献（略）