生物反应器生产狂犬病疫苗的工艺应用
用国产生物反应器培养Vero细胞和狂犬病毒_张立
用国产生物反应器培养Vero细胞和狂犬病毒¹张 立º 范为民 严 春 陆 健 张元兴 宋瑶君 赵一鸣 陈文兰 俞俊棠(华东理工大学生物工程学院 上海200237)摘 要 介绍了国产生物反应器CellCul-50A的特点及性能,并利用此生物反应器培养了V ero细胞和狂犬病毒,细胞密度达1.1×107cells/ml,病毒滴度也得到了满意的结果。
关键词 生物反应器,CellCul-50A,细胞培养,Vero细胞,狂犬病毒0 引言 随着基因工程的发展,通过动物细胞培养能生产出各种疗效很好的药物、灵敏度很高的诊断试剂以及其它生物制品,如用Vero细胞生产乙脑病毒[1]和狂犬病毒[2],用草鱼吻端细胞培养生产草鱼出血热疫苗[3],用鸡胚细胞培养生产鸡法氏囊病病毒疫苗[4,5]等。
90年代初,利用基因工程和细胞工程等现代生物技术生产的蛋白药物,如HBsAg、EPO、tPA等一批产品,大量进入市场[6]。
蛋白药物的生产正发展成为一支高新技术产业。
通过细胞培养进行的病毒或蛋白产品的生产,其唯一途径是细胞的大规模培养。
这些细胞大多是贴壁依赖性细胞,让其贴附在微载体上在生物反应器中进行培养是最常用和最有效的模式[7]。
由于动物细胞与微生物有很大的差异,如动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求,传统的微生物发酵用的反应器不适用于动物细胞的大量培养,因而对动物细胞培养用反应器的设计和过程控制提出了特殊的要求。
自70年代以来,细胞培养用生物反应器有了很大的发展,种类越来越多,规模越来越大,反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主。
在国外,气升式反应器已放大到5000～10000L[8],搅拌式反应器已放大到8000L[9]。
我国在“七五”期间开始这方面的研究,已成功地研制了CellCul-20A细胞培养用生物反应器[10]。
“八五”期间,我们研制的50L细胞培养用生物反应器CellCul-50A保留了CellCul-20A的优点,并根据细胞生长对培养环境的特殊要求进行了改进。
微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗
微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗乐威;叶林柏;张捷;刘静【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2004(019)004【摘要】本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术.在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0～8.5log LD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到<中国生物制品规程>2000年版要求.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行.【总页数】3页(P373-375)【作者】乐威;叶林柏;张捷;刘静【作者单位】武汉大学生命科学院病毒研究所,湖北武汉,430072;武汉生物制品研究所,湖北武汉,430060;武汉大学生命科学院病毒研究所,湖北武汉,430072;武汉大学生命科学院病毒研究所,湖北武汉,430072;武汉生物制品研究所,湖北武汉,430060;武汉大学生命科学院病毒研究所,湖北武汉,430072【正文语种】中文【中图分类】R512.99【相关文献】1.微载体培养Vero细胞精制狂犬病疫苗的研究 [J], 鞠长军2.微载体灌注培养Marc-145细胞制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗 [J], 杨雷;李伟;漆世华;秦红刚;韩兴;谢红玲;温文生;吴玉石3.应用微载体Vero细胞制备流行性乙型脑炎灭活疫苗最适条件的研究 [J], 庞成华;石慧颖;常振彦;陈景才;丁志芬4.VERO细胞—微载体系统制备乙脑疫苗的研究 [J], 宋家骊;陈列胜;贺适民;李文勤;徐殿胜;董树沛5.Vero细胞微载体悬浮培养制备人用狂犬病疫苗的研究 [J], 顾悦翔;梁本;褚菊仁;李广善;付琳;朱关福因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
狂犬疫苗的生产工艺
狂犬疫苗的生产工艺狂犬疫苗是用于预防狂犬病的重要疫苗。
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种严重传染病，患者一旦感染极易死亡。
因此，狂犬疫苗的生产工艺至关重要。
首先，狂犬疫苗的生产工艺开始于病毒分离。
研究人员通过采集狂犬病患者的体液样本，特别是唾液和脑组织样本。
然后，将这些样本接种到实验动物身上，如小白鼠或小狗，让病毒在这些动物体内复制增殖。
一旦病毒分离成功，研究人员将在实验室中对病毒进行培养。
接下来，狂犬病病毒经过培养后，会将病毒制备成病毒抗原。
这个过程包括病毒的提取和纯化。
研究人员将培养液离心分离出病毒，然后使用一系列的化学和生物技术手段，如超离心、凝胶过滤和柱层析等，将病毒纯化为高纯度的病毒抗原。
然后，研究人员将病毒抗原灭活，使其失去活性。
这样做的目的是防止病毒抗原在后续的疫苗生产过程中继续复制和感染宿主。
通常，病毒抗原会经过一定的时间和温度处理，以确保病毒完全失活。
灭活后的病毒抗原具有一定的免疫原性，可以引起人体产生免疫应答。
接着，灭活的病毒抗原会与辅助物质混合，以提高疫苗的免疫效果。
这些辅助物质包括佐剂和防腐剂等。
佐剂可以增强疫苗的免疫原性，使得疫苗具有更好的免疫效果；防腐剂则用于防止疫苗在保存和使用过程中受到污染和损坏。
最后，疫苗会进行灌装和包装。
研究人员将制备好的疫苗按照一定的剂量装入瓶子中，并进行密封。
通常狂犬疫苗以液体形式保存，因此密封瓶子的选择和密封工艺非常重要，以确保疫苗在贮存期间不受污染和破损。
总结起来，狂犬疫苗的生产工艺包括病毒分离、培养和纯化、病毒灭活、加入辅助物质、疫苗灌装和包装等步骤。
通过严格的工艺控制和质量检验，研究人员可以生产出高质量的狂犬疫苗，为狂犬病的预防提供有效的手段。
狂犬疫苗生产工艺
狂犬疫苗生产工艺狂犬疫苗是一种用于预防狂犬病的疫苗，它是通过制备、培养和灭活狂犬病病毒并进行灭活制剂的制备来实现。
狂犬疫苗的生产工艺如下。
首先，需要准备狂犬病病毒株。
目前常用的狂犬病毒株有血清媒介的毒株和组织培养的毒株。
在生产中，选择某一株病毒，通过传代培养和扩增来获得病毒种子。
接下来，需要将病毒株接种到合适的细胞种子上。
常用的细胞种子包括鸟胚细胞、绵羊肾细胞和Vero细胞等。
将病毒株接种到细胞种子后，保持一定的温度、PH值和营养液条件下进行培养。
当病毒感染细胞后，需要经过一定的时间来扩增病毒的数量。
此时应定期检测细胞内是否存在有效的病毒感染。
当细胞内病毒感染达到一定水平后，需要对细胞进行破碎以释放病毒。
一般的方法有冻融法、超声波法和酶解法等。
破碎后，通过离心和过滤等方法来获得病毒液。
获得病毒液后，需要对病毒进行灭活。
常用的灭活剂有用酸亚硫酸、β-普萘酚和乙醚等。
灭活的时间和灭活剂的浓度等关键因素需要进行严格的控制，以确保病毒完全失活。
完成灭活后，病毒液需要进行精制和纯化。
常用的方法有沉淀法、硝酸盐法、硫酸铵法和超滤法等。
通过这些方法可以去除污染物和无效成分，从而得到纯净的病毒灭活制剂。
最后，将纯化的病毒灭活制剂进行配制和包装。
一般将其加入到适当的稳定剂中来延长疫苗的保质期，并使用适当的容器进行包装和密封。
以上就是狂犬疫苗的生产工艺概述。
狂犬疫苗生产工艺需要在严格的细胞培养和病毒操作条件下进行，以确保病毒的纯净性和有效性。
在生产过程中，需要严格控制各个环节的参数和操作，以确保疫苗的质量和安全性。
狂犬疫苗的工艺流程
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无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立
无血清培养基培养 Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立摘要：文章主要是分析了Vero 细胞无血清培养基的组成，在此基础上讲解了Vero细胞无血清细胞培养基的发展，望可以为有关人员提供到一定的参考和帮助。
关键字：Vero细胞；无血清培养基；研究进展1、前言当前现代细胞工程的不断发展，无血清培养基培养Vero细胞作为其中的基质生产疫苗已被广泛的应用，市场上的商品化Vero细胞无血清培养基主要是使用到无血清培养基以及无血清无动物源成分的培养基，其可以有效维持到细胞在体外的生长以及增值，但其中还是存在了一定的污染可能，这会在一定程度上使得疫苗存在一定风险。
2、组成2.1、基础培养基葡萄糖是血液生长、增殖和产物表达过程中的重要能量来源。
通过对血清培养Vero细胞中枢代谢的研究，发现葡萄糖主要参与葡萄糖代谢，而谷氨酰胺是三羧酸循环中最重要的碳源。
用天门冬酰胺和丙酮酸钠代替谷氨酰胺作为碳源，才可以有效的减少到了次级代谢的产物（如乳酸和氨）对细胞的伤害，且谷氨酰胺易被降解，在新形成的培养基中加入等量的谷氨酰胺。
2.2、主要添加因子在Vero无细胞培养的早期研究中，主要是加入到了一些牛（人）血清白蛋白和转铁蛋白，然后有效的促进到了细胞的生长。
然而，血清白蛋白不仅能调节渗透压，能够有效的保护到了细胞免受受到机械的损伤，而且能与维生素、脂类激素、金属离子和生长因子结合，使这些物质在血清培养中的活性转移到血清培养中，具有结合毒素和还原蛋白酶的作用。
通过新的研究发现Vero细胞无血清培养物现在用于用植物蛋白质水解酸盐可以替换成了血清白蛋白。
该蛋白质是复杂的，其中主要是包括了氨基酸，寡肽，橄榄果多酚和纤维。
目前，最常用的植物水解产物是大豆植物水解产物，小麦植物水解产物和水稻水解产物。
这些植物蛋白质使疫苗更加安全。
转铁素是无细胞培养物中最重要的额外组分，这可能导致细胞生长抑制。
在没有动物来源成分的Vero细胞培养基研究中，认为铁柠檬酸铁和维生素C的混合物可以取代转铁蛋白。
疫苗生产中的生物反应器优化
疫苗生产中的生物反应器优化疫苗作为预防和控制传染病的重要手段，其生产质量和效率至关重要。
在疫苗生产过程中，生物反应器的优化是提高疫苗产量、质量和降低成本的关键环节。
生物反应器为细胞生长和代谢提供了适宜的环境，通过对其进行优化，可以更好地满足疫苗生产的需求。
生物反应器的类型多种多样，常见的有搅拌式生物反应器、气升式生物反应器和流化床生物反应器等。
不同类型的生物反应器具有各自的特点和适用范围。
例如，搅拌式生物反应器通过搅拌桨的作用使培养基混合均匀，适用于大多数细胞培养；气升式生物反应器则利用气体的上升带动培养液循环，具有较低的剪切力，适合对剪切敏感的细胞培养。
在疫苗生产中，细胞培养是核心环节之一。
为了实现高效的细胞培养，需要对生物反应器中的多个参数进行优化。
首先是温度控制。
细胞在不同的生长阶段对温度的要求有所不同，通常需要将温度维持在一个适宜的范围内，以促进细胞的生长和代谢。
例如，某些疫苗生产中所使用的哺乳动物细胞，其最适生长温度一般在 37℃左右，但在病毒感染和复制阶段，可能需要适当调整温度来优化病毒的产量。
其次是pH 值的调节。
细胞内的各种生化反应都对pH 值较为敏感，因此维持培养液 pH 值的稳定对于细胞生长和产物合成非常重要。
通常会使用缓冲体系来维持 pH 值的稳定，同时通过在线监测和自动控制系统及时调整酸碱的添加量。
溶氧水平也是一个关键因素。
充足的氧气供应对于细胞的呼吸作用和能量代谢至关重要。
通过优化通气策略，如调整通气量、气体组成和搅拌速度等，可以确保细胞获得足够的氧气，同时避免过度通气导致的泡沫产生和细胞损伤。
除了这些物理化学参数，培养基的组成和营养物质的供应也对细胞生长和疫苗产量有着重要影响。
合理设计培养基配方，提供充足的碳源、氮源、维生素和矿物质等营养物质，可以满足细胞的生长需求。
同时，采用补料策略，根据细胞的生长状态和代谢情况适时补充营养物质，可以进一步提高细胞密度和疫苗产量。
生物反应器的结构设计对于疫苗生产也具有重要意义。
狂犬疫苗介绍
成大生物狂犬病疫苗一) 技术来源1984年11月，世界卫生组织（WHO）和洛克菲勒基金会（RF）开始一项合作项目——以V ero细胞为基质工业化生产狂犬病疫苗。
历时15年的努力，科学有效地解决了生产、纯化中的诸多问题。
1999年，该技术生产的高品质人用狂犬病纯化疫苗首先被批准在哥伦比亚使用，经过5年的实践，证明具有卓越的安全性和免疫效果。
该技术的核心在于实现了细胞的悬浮培养。
(二) 主要技术1、高密度微载体技术1) 微载体的诞生实现了细胞从贴壁生长到悬浮培养的革命。
成大速达®的微载体技术指标：1个微载体= 180μm1克微载体（干重）= 4,400cm2500克微载体= 1,000转瓶（3升转瓶）7.5升反应器= 150 克微载体= 350 转瓶30升反应器= 750 克微载体= 1,750 转瓶细胞密度: 10 x 106个细胞/ml细胞生长30 L 生物反应器= 7 天病毒生长天数= 20 天从上图我们可以看到细胞在微载体表面生长的非常好，细胞密度达107/ml。
刚才已经谈过，巴斯德PV2061狂犬病固定毒毒株是WHO公认的免疫原性高的V ero细胞适应株，因此，接种病毒后，连续收获病毒的滴度很高，这样从技术上就保证了成大速达®0.5ml的小剂量里面，能够含有较高的抗原蛋白和较少的杂蛋白。
2) 生物反应器为大规模细胞培养提供了设备支持。
全自动、封闭式、管道化的生物反应器3) 比照传统生产工艺，微载体高密度细胞培养的优势：* 高细胞密度* 高病毒收获* 低污染的机会* 生产工艺可控性强* 微载体投放量高达25g/L，细胞密度高达1.1-1.5x107/ml，远超过其他工艺（转瓶、细胞工厂、其他类型反应器）。
2、四柱层析纯化系统从前面的工艺流程中，我们已经知道，收获的病毒液必须经过无菌连接的管道化的澄清过滤和超滤浓缩后，灭活，然后，进行层析纯化。
下面的图中显示先进的纯化设备和训练有素的工作人员在操纵全自动的装备，经过这道关键的工艺后，有效地去除99.95%的杂蛋白和V ero 细胞DNA，保证了成大速达®具有卓越的安全性。
生物工程技术在新型疫苗研发中的应用
生物工程技术在新型疫苗研发中的应用新型病毒不断涌现，给全球公共卫生带来了严重的挑战。
为了有效应对疫情，疫苗的研发变得尤为重要。
在这一方面，生物工程技术的应用功不可没。
生物工程技术是指通过基因改造等手段，对生物体或其组织、细胞和分子进行修饰，以实现特定的功能或用途。
在疫苗研发中，生物工程技术的应用有以下几个方面：一、基因工程技术制备新型疫苗的最常见方法之一就是利用基因工程技术。
疫苗的主要原理是通过刺激人体免疫系统来抵御病原体的入侵。
疫苗通常由病原体的抗原组成，而抗原的来源可以是病原体本身或其分离出的蛋白质。
基因工程技术可以把病原体蛋白质的基因克隆到无害的载体上，再将这些基因引入细胞中表达出抗原，以制备疫苗。
基于基因工程技术制备的疫苗，有很多病原体可以用。
例如，人乙型肝炎病毒（HBV）疫苗就是使用基因工程技术制造的。
HBV是一种病毒性肝炎，传染性很强，极易在血液性接触和污染的物品传播。
使用基因工程技术制备的疫苗，能够对HBV进行有效的免疫，保护人类健康。
二、质粒DNA疫苗质粒DNA疫苗是一种新型的疫苗制备方法。
这种疫苗的特点是采用质粒DNA作为抗原，直接注射到机体内部，通过细胞内的转录和翻译，产生抗原蛋白，从而诱导机体免疫应答。
这种疫苗集成了DNA技术和免疫学原理，具有更快、更便捷、更安全、更高效的优点。
质粒DNA疫苗已经被应用于多种疾病的预防和治疗中，例如乙型脑炎、口蹄疫、肺结核、狂犬病等。
近年来，这种疫苗也被应用于新冠肺炎的治疗研究中，取得了一定的进展。
三、蛋白互补技术蛋白互补技术是基于生物信息学和化学合成技术的一种新型疫苗研发方法。
这种技术能够根据病原体序列信息，精确地合成出能够诱导机体免疫应答的抗原蛋白。
蛋白互补技术的制备过程相对简单，而且抗原蛋白质纯度高、效价稳定，因此能够产生更好的免疫应答。
近年来，这种技术已经被应用于甲型H1N1流感疫苗的开发中，并且取得了很好的效果。
四、病毒载体技术病毒载体技术是指将病毒作为疫苗载体，通过改造、合成或插入特定抗原基因，制备疫苗的一种新兴技术。
典型生物制品的制备—人用狂犬疫苗的制备
材料
Vero细胞 微载体 Phamacia Cytodex-1 培养基 Vero细胞培养使用MEM培养基(Gibco),加入10%新生牛血
清;病毒培养液为M199(Gibco),加入1%人血白蛋白, 100U/ml双抗 病毒种子 aG株 实验动物 鼠。鼠龄21 d,体质量11~13 g。 生物反应器 7 L搅拌生物反应器，工作体积为5 L
规格 每瓶1.0ml 每一次人用剂量为1.0ml 狂犬病疫苗 效价应不低于2.5IU
于2~8度避光保存和运输。自生产之日起，按批准的执行
检定
1.单次病毒收获液
病毒滴定 应不低于6.0LgLD50/ml
2.成品检定
鉴别试验 采用酶联免疫法(ELISA法)检查，应证明含有狂犬病病毒抗原
外观应为澄明液体无异物
3.化学检定
PH值
应为7.2—8.0
效价测定
应不低于2.5IU/剂
细胞内毒素检查
应不高于50EU/剂
牛血清蛋白残留量
应不高于50ng/剂
VERO细胞DNA残留量 应不高于100pg/剂
VERO细胞宿主蛋白残留量测定 采用酶联免疫法测定，应不高于4ug/ml,并不得 超过总蛋白质含量的5%
问题：
1.为什么要使残余β-丙内脂水解？（师）
浓度为1∶4 000β-丙内脂溶液灭活,于4℃连续搅拌24 h。 将灭活后的疫苗加入适当的Al(OH)3佐剂制备成试验疫苗。
纯化
半成品
成品
保存、 运输及 有效期
灭活后的液体采用柱色谱或其他适宜的方法纯化，纯化 后可加入适量人血白蛋白或其它适宜的稳定剂即为原液
配制 用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量及抗原量进行配制， 配置后总蛋白质含量应不高于80ug/剂，可加入适量硫柳汞作为 防腐剂，即成半成品
一种制备伪狂犬病疫苗的方法[发明专利]
![一种制备伪狂犬病疫苗的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f4c6da6aa0116c175e0e4806.png)
专利名称：一种制备伪狂犬病疫苗的方法专利类型：发明专利
发明人：张许科,孙进忠,乔荣岑
申请号：CN201010513457.4
申请日：20101015
公开号：CN101979519A
公开日：
20110223
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用潮汐式生物反应器培养传代细胞生产伪狂犬病疫苗的方法：(1)复苏细胞进行传代培养；(2)应用特定生物反应器和载体系统进行细胞的高密度培养，让细胞在载体上贴附，让培养基循环、充氧、调控pH值和葡萄糖；(3)应用生物反应器进行病毒感染，更换成病毒培养基，接入病毒，让病毒在细胞上吸附完全；(4)特定的条件培养、扩增病毒；(5)收获病毒；(6)加入冻干保护剂，混匀，定量分装，冻干，获得伪狂犬病活疫苗。
申请人：洛阳普莱柯生物工程有限公司
地址：471000 河南省洛阳市洛南新区政和路15号
国籍：CN
代理机构：北京华夏正合知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：韩登营
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应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法[发明专利]
![应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3dd1270d998fcc22bdd10ddf.png)
专利名称：应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法
专利类型：发明专利
发明人：张智明,任德强,戴秀莉,武佳斌,臧玉婷,张立恒,潘兴广,姜力,吴金
申请号：CN201210166479.7
申请日：20120525
公开号：CN102690791A
公开日：
20120926
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法，本发明的方法包括如下步骤：(1)选择ST细胞作为制苗用细胞系；(2)ST细胞的传代与培养；(3)猪伪狂犬病病毒细胞毒种的繁殖；(4)ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养；(5)猪伪狂犬病病毒液的繁殖；(6)收获病毒液的处理。
本发明的优点是：细胞活力≥90％、活细胞密度≥1×10cells/mL，病毒液TCID≥10。
生产过程衔接紧密、顺畅，规模放大容易，生产周期短，占用场地小，环境污染少且易于处理，病毒液收获方便，质量易于实现均衡稳定，可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。
申请人：哈药集团生物疫苗有限公司
地址：150069 黑龙江省哈尔滨市动力区哈平路新发屯
国籍：CN
代理机构：北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司
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生物反应器生产狂犬病疫苗的工艺应用
作者：张瑜
来源：《兽医导刊》 2016年第3期
狂犬病是一种致死率非常高的人畜共患病，我国列为甲类传染病，是重要防控疫病。
由于
尚无非常有效的治疗方法，因此暴露于该病原后，接种疫苗是最重要预防措施之一。
2015 年OIE 的狂犬病控制计划指出，95% 的人狂犬病是由病犬咬伤所致，如果实现70% 以上的犬免疫，可将人的狂犬病发病率极大降低。
与人预防该病相比，所消耗的费用成本节约近10 倍。
此外
加强狗和野生动物狼等易感动物免疫是逐渐净化本病的根本方法。
自从1885 年，Louis Pasteur首次用兔脑和脊髓制备了狂犬病弱毒疫苗，成功保护了第一位狂犬病野毒暴露者。
此后，在疫苗安全性和免疫效果方面不断改进和提高。
狂犬病疫苗经历
了神经组织疫苗，禽胚疫苗，细胞培养疫苗的发展历程。
一、狂犬病疫苗毒株及培养基质
1. 狂犬病疫苗的发展。
最早的狂犬病疫苗是用感染疫苗毒株的动物脑和脊髓神经组织制备而成。
由于其效价低，免疫产生抗体水平较差，且含有大量神经髓磷脂，存在引发变态反应等
缺点。
此后，开发出禽胚组织培养狂犬病疫苗。
1955年，Peck 制备了鸭胚疫苗（DEV）。
虽然
鸭胚疫苗在生产工艺又有进一步改善，引起变态反应的危险性降低，但仍然表现出免疫后抗体
效价低的特点。
第三代疫苗走上历史舞台，将狂犬病病毒适应于细胞培养，生产细胞培养狂犬
病疫苗，主要包括原代细胞疫苗、二倍体细胞疫苗和传代细胞疫苗。
随着生产工艺改进，第三
代疫苗免疫效果好，副反应少，能够实现大批量生产，肩负起了目前免疫防控狂犬病的重任。
虽然，狂犬病基因工程疫苗也进行很多研究，包括重组活载体疫苗、亚单位疫苗和基因疫苗等。
2. 狂犬病疫苗毒株。
由于狂犬病分布广泛，各个国家和地区依据本国疫情流行情况，培养筛选出不同的狂犬疫苗毒株。
应用最为广泛的毒株来源于3 个疫苗株：1882 年从狂犬病病犬
脊髓分离并通过兔体传代的固定毒巴斯德株(Paris-Pasteur株) ；1939 年从美国一个患病女
孩脊髓悬液经鼠脑传代分离，以鸡胚传代的固定毒Flury 株；1935 年美国一个患病犬体内分
离的SAD 株，经鼠脑传代固定毒SAD 株。
SAD 株是弱毒疫苗株，经过分离筛选出的SAD Bern, SAG2, 和SAD B19 等毒株，生产弱毒口服疫苗，在欧洲广泛用于野生动物的免疫，取得了明显
的疫病防控效果。
为了排除口服弱毒疫苗SAD 株免疫动物后毒力返强的可能性，进行了现有弱
毒株基因重组，以用于更换现有的口服弱毒疫苗株。
3. 狂犬病疫苗培养基质。
原代细胞培养相对简单，能够用于较多狂犬病毒株培养。
狂犬病毒SAD 株、Paris-Pasteur 株和aGT 株适应原代地鼠肾细胞培养，Flury-LEP 株及Flury-HEP 在鸡胚成纤维细胞上培养，生产出弱毒疫苗和灭活疫苗，广泛用于人和动物的狂犬病预防免疫。
原代细胞质量有批间差异，存在潜在的病毒等外源因子污染等缺点，应用变少。
二倍体细胞与原代细胞相比，具有能够充分鉴定和标准化的优点，可实现细胞种子库系统，建立的细胞库可多年用于生产，有利于质量控制。
但其对培养条件要求较为苛刻，生产成本也
较高，价格昂贵，兽用疫苗应用较少。
传代细胞与二倍体细胞优点相似，但其易于培养，而得
到较为广泛应用。
1962 年，日本千叶大学学者分离培养出非洲绿猴肾细胞（Vero），适用于
狂犬病毒株CTN、aG 和PM 株的灭活疫苗生产，用于狂犬病预防。
我国于1995 年开始进行人
用纯化Vero 细胞狂犬病疫苗的研制，已有多家生物制品公司获得了生产文号。
1961 年，
A.Macpherson 和M.G..P.Stoker从1 日龄仓鼠分离出幼仓鼠肾细胞（BHK），并培养成为细胞系。
BHK细胞对狂犬病病毒敏感性高，增殖培养PM 株、ERA 株SAD 株及CTN-181 株等毒株。
法国维克用BHK-21 细胞培养（VP12 株）生产的犬、猫用狂犬病疫苗，获得了在法国生产文
号，并在我国进行了注册。
在国内，BHK-21 传代细胞培养HEP-Flury 株生产灭活疫苗，经过
安全性和免疫效力检验合格，NIH 检验达到2IU。
二、生物反应器细胞培养狂犬病疫苗工艺应用
1962 年，Capstile 成功完成BHK-21 细胞大规模悬浮培养。
1967 年，Van Wezel 首先开
创了微载体细胞培养技术，标志生物反应器培养动物细胞技术的起步。
经过几十年的发展，其
已广泛用于疫苗生产领域，因其具有节约生产所需的空间，生产过程易于监控，实现自动化、
规模化生产，降低批次产品间差异的优点。
生物反应器生产疫苗工艺正在被广泛接受。
狂犬病疫苗生产用细胞为贴壁依赖性，包括原代细胞、二倍体细胞和传代细胞，适用于生
物反应器微载体培养。
培养类型分为微载体悬浮培养和固定床微载体培养。
微载体悬浮培养工
艺采用搅拌桨式生物反应器，能够悬浮的球状载体。
依据病毒株和细胞的培养特点，优化狂犬
病疫苗生产工艺，通过对反应器物理结构等比例放大，应用于生产。
1984 年，法国Merieun
研究所在微载体悬浮培养的Vero 细胞上繁殖狂犬病毒PM1503-3M 株，制备出纯化Vero 细胞
狂犬病疫苗（PurifiedVero Rabies Vaccine, PVRV）。
该苗免疫原性好、安全、稳定，可大规模生产，产量高，价格便宜，WHO推荐使用Vero 细胞大量生产狂犬疫苗。
搅拌桨生物反应器培养BHK-21 细胞，接入狂犬病PV 株种毒，培养出高滴度病毒抗原液，便于下游纯化工艺，制
备出低成本，免疫效果好的疫苗。
Cytodex1 微载体悬浮培养Vero 细胞，与常规含血清培养液
相比，无动物成分培养液更适于Vero 细胞生长，得到更高效价抗原液。
该工艺的开发，将简
化下游工艺，降低疫苗副反应。
固定床微载体细胞培养生物反应器突破原有技术瓶颈，逐渐扩大应用范围。
固定床微载体
多采用具有一定结构的聚酯纤维载体例如Fibra-Cel disks 和BioNOC II Matrix。
有实验发现，与Cytodex1 载体悬浮培养相比，固定床载体Fibra-Celdisks 的培养的细胞密度更高，单位
细胞产能，病毒产毒量均有提高。
固定床生物反应器一般具有较低细胞剪切力，独特的暴气方
式和传质效率等特点，形成特有的培养体系。
与搅拌桨反应器相比，iCELLis 固定床生物反应
器更适于MRC-5 细胞培养。
固定床反应器的载体为大孔微载体，存在生物反应器逐级放大和大
体积培养的工艺瓶颈，因此更适于致细胞病变弱的狂犬病毒株的生产。
狂犬病仍是我国需要防控的致死率高的烈性传染病，而被患病犬咬伤是主要根源，因此应
加强与人类接触频繁的宠物犬和流浪犬等免疫。
随着国家对易感动物强制接种的力度不断加大
和未来启动净化本病，对狂犬疫苗灭活疫苗和口服弱毒疫苗的需求也会日益增加。
结合我国狂
犬病兽用疫苗株和细胞特点，选用合适生物反应器建立疫苗抗原生产工艺，生产出价格低的优
质病毒抗原液。
为保证产品具有稳定免疫效力，较高的安全性和最低副反应，生产企业应对狂
犬病疫苗下游浓缩，纯化和配苗佐剂的工艺进一步开发，以提供充足有效的狂犬病疫苗。
参考文献（略）。