人脐带血来源间充质干细胞的成脂分化

全科口腔医学杂志

General Journal Of Stomatology

2019 年

1月 第6卷/第1期V ol.6, No.1 Jan. 2019

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人脐带血来源间充质干细胞的成脂分化

杨旭芳1，冯 华1，杨云芳2，陈 培1，李福娟3*

（牡丹江医学院1.病理生理教研室；2.数学教研室；3.免疫与病原实验室，黑龙江 牡丹江 157011）

【摘要】目的 本文利用Ficoll- Hypague 法自人脐带血中分离、培养及扩增出人脐带血来源间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells ，hUCBMSCs ）；并对其成脂分化能力进行鉴定。方法 显微镜下观察各代hUCBMSCs 的形态学特点；利用流式细胞术检测各代hUCBMSCs 免疫学表型；取P3代细胞进行成脂肪分化，镜下观察细胞形态及是否出现脂滴。结果 体外分离、培养出形态均一的hUCBMSCs ；流式结果显示hUCBMSCs 具有间充质干细胞的免疫学特征，即CD44、CD73、CD105阳性；成脂诱导后4天细胞形态发生变化，分别于诱导后1周、2周胞浆中出现明显脂滴。结论 成功的从人脐带血中分离培养出了人脐带血来源间充质干细胞，其具有高效的成脂分化能力，未来在整形医学领域种子细胞的研究中将具有重要的意义。

【关键词】人脐带血来源间充质干细胞；成脂分化

【中图分类号】R457.7 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8803.2019.1.146.02

细胞治疗被认为是当前攻克难治性组织损伤修复的新型疗法[1]。因为干细胞具备旺盛的增殖及多向分化能力等生物学特征，细胞治疗常常选其作为种子细胞。常见的可用于细胞移植治疗的干细胞种类为胚胎干细胞、诱导的多潜能干细胞及骨髓、羊水等多种中胚层来源的组织中的间充质干细胞[2-3]。但胚胎干细胞的来源受限及所面临的伦理学问题，诱导多潜能性干细胞获取的技术方法复杂，成体干细胞（间充质干细胞）则成为了优质的种子细胞来源，同其他来源的间充质干细胞相比，脐带血中间充质干细胞含量丰富，因细胞更为原始、来源无创（源于生产后废弃的脐带）、供体不会受到损伤，患者容易接受、无免疫原性，故不会引起排斥反应、无社会伦理问题等特点[4-5]，上述特点决定了人脐带血来源的间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived stem cells ，hUCBMSCs ）较其他成体干细胞更具有临床应用价值，因此，hUCBMSCs 将会成为组织修复、整形治疗中极具优势的种子细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

脐带血来源于附属医院产科。低糖DMEM(Hyclone ，USA)，10%胎牛血清（Hyclone ，USA ），0.25%胰酶（Invitrogen ），Ficoll-pague 淋巴细胞分离液（华雅再生医学生物工程技术有限公司），抗CD44、CD73及CD105单克隆抗体购于BioLegend 公司。

1.2 方法

1.2.1 脐带血标本采集

选取我校附属第一医院妇产科足月自然产的健康孕妇，征求其同意，无菌操作获得脐带血50 mL ，轻摇血袋以防凝血，于2小时内送至实验室，4℃冰箱保存，12小时内进行分离培养。

1.2.2 hUCBMSCs 的分离与培养

PBS 缓冲液与脐带血按照1:1混匀稀释，再与Ficoll-pague 淋巴细胞分离液（1.077 g/mL ）按1:1的体积将稀释液缓慢加于其上，2000 r/min 低温下离心20分钟，将云雾

状的乳自色单核细胞层轻轻吸出。PBS 洗涤细胞吸出液2次，1000 r/min 离心5分钟，用条件培养基（LG-DMEM 、10%FBS 、100units/mLpenicillin ，100μg/mLstreptomycin ）重悬位于最下层的片状沉淀[9]，调整细胞密度，每毫升约为1×106个，接种于6孔板中，放置于5%CO2、37℃的孵箱内培养，4天后半量换液，之后每隔3天换液一次，待细胞接近融合（长满80～90%）时，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 轻轻消化贴壁细胞，按1:3的比例进行传代培养，镜下观察各代次hUCBMSCs 的形态特点。

1.2.3 流式细胞仪检测hUCBMSCs 表面标志

0.25%胰酶-0.02%EDTA 消化收集不同代次细胞，每例样本细胞数为2×105个左右；细胞重悬于1mL0.01M PBS 中洗涤2次，1500 r•min-1，10分钟；弃去PBS ，与一抗孵育液（一抗稀释度为1：100）常温下孵育30分钟；0.01M PBS 洗涤2次后，分别与FITC －二抗（稀释度为1：50）4℃避光孵育30分钟；0.01MPBS 洗涤2次后，弃去PBS ，再加入300 μl 0.01M PBS 重悬细胞，用于流式细胞仪分析。

1.2.4 hUCBMSCs 成脂定向分化

消化收集细胞，调整细胞密度为1×105•mL-1,接种于24孔板，实验分两组，即非诱导组（对照组）与成脂诱导组，24小时后成脂诱导组换为脂肪诱导培养基[7]（LG-DMEM ，10%FBS ，1μmo•L-1地塞米松，50μmol•L-1吲哚美辛，0.5mmoL•L-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤；10 μmoL•L-1胰岛素），每3天更换培养液1次，分别于诱导1和2周后，0.1moL•L-1 PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定20分钟，显微镜下观察照相。

2 结 果

2.1 hUCBMSCs 的形态学特点

倒置显微镜下可见：hUCBMSCs 形态均一，细胞胞体狭长，呈现成纤维细胞样，细胞接近融合时，则呈现鱼群样或漩涡样排列。

2.2 hUCBMSCs 表面标志

利用流式细胞术对P3、P6和P10代hUCBMSCs 的免疫学

基金项目：黑龙江省卫生厅科研项目（2011-324）；牡丹江医学院科学技术项目研究（2011-02）

作者简介：杨旭芳（1974-），女，黑龙江牡丹江人，博士，副教授，主要从事干细胞组织工程学研究通讯作者：李福娟（1979-），女，黑龙江牡丹江人，实验师，硕士，主要从事免疫学和病原生物学研究