农残分析12--农药残留的酶抑制法与免疫测定

6.1.3 酶源选择与提取 酶源选择是生物酶技术应用的基础,其 性质的好坏,特异性大小,稳定与否直接关系 到检测的结果. 在酶抑制检测的技术中,既有应用 AChE的,也有应用非特异性酯酶的,其来源 既有动物的,也有植物的. 6.1.4 底物和 显色剂 酶抑制剂显色反应可使用的底物和显 色剂很多,大致可分为以下几类:
1)多克隆抗体技术
多克隆抗体是由许多B淋巴细胞克隆产生的混合抗体.
2)杂交瘤技术生产单抗
单克隆抗体是指由一个B淋巴细胞分化增殖的浆细胞 产生的针对单一抗原决定簇的抗体.
(6)ELISA方法的选择
分为五种类型: 1)酶标抗原直接竞争抑制法; 2)酶标抗体直接竞争抑制法; 3)酶标抗体间接竞争抑制法; 4)抗体夹心法; 5)间接夹心法
农药残留的酶抑制法与免疫测 定技术
6.1 酶抑制分析测定法
1951年,Giang与Hall应用有机磷和氨基甲酸 酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理来 测定其含量. 1968年Mendoza利用薄层-酶抑制技术测定 10种有机磷和氨基甲酸酯农药,最小检出量可达纳 克水平. 1975年Kramer与Gamson用一种与靛酚乙酸 酯相似的化合物,测定1~10μg的各种有机磷酸酯 化合物,与此同时,Zweig等也测定了甲萘威等农药. 进入20世纪80年代,人们开始以来源丰富,取 材和制备都十分方便的植物酶源,建立薄层-植物 酯酶抑制方法,为酶抑制法的进一步推广和应用创 造了条件.
2类: 首先固定抗体，然后同时加入待测抗原和酶标 记抗原，待测抗原与酶标记抗原竞争有限量的固 相抗体，反应后测定固相抗体与酶标记抗原结合 物上的酶活性，便可得到待测抗原的量。 酶活性 强度与待测抗原呈负相关。 (2) 间接ELISA原理 首先固定抗原，然后加入待测抗原和抗体， 固相抗原与待测抗原竞争有限的第一轮抗体，反 应后洗去游离的结合物，再加入酶标记的第二抗 体(以第一抗体为抗原的酶标记抗体)，反应后吸 取酶标记的游离抗体，测定结合物上的酶活性。 酶活性与待测抗原浓度呈负相关。
(1)直接ELISA原理:
是在抗原与抗体发生反应后，直接进行显色 的非均相固相反应免疫分析方法。 1类:首先将抗原固定在聚苯乙烯反应板孔内壁， 然后加入待测抗原和酶标记抗体，固相抗原与待 测游离抗原竞争有限量的酶标记抗体，反应后洗 去可溶性的游离抗原与抗体的结合物，加入酶作 用底物，测定固相抗原与抗体结合物上的酶活性， 便可得到待测抗原的量。酶反应活性与待测抗原 的量呈负相关.
6.1.2 酶法检测原理 有机磷和氨基甲酸酯类农药 对参与神经生理传 递过程的乙酰胆碱酯酶AChE具有抑制作用,使该酶 的分解作用不能正常进行,从而导致底物乙酰胆碱的 积累,影响动物正常的神经传导,引起中毒或死亡. 可将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测 中,如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有 机磷或氨基甲酸酯类农药,酶的活性就不被抑制,试样 中加入的基质就被酶水解,或少部分水解, 水解产物 与加入的显色剂反应产生颜色;反之,如果试样提取液 中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药, 酶的活 性就被抑制,试样中加入的基质就不被酶水解, 从而 不显色或颜色很浅,用分光光度计测定吸光度值,计算 出抑制率,就可判断出样品中农药残留情况.
(7)实验条件的选择
必须注意以下几个方面: 1)确定酶结合的最适浓度. 2) 确定包被物质的最适浓度. 3)样品往往会产生交叉反应. 4)样品前处理时,使用的溶液必须考虑其影响抗体 对分析物识别的可能性.
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(8)ELISA法的特点:
1)适用现场快速筛选; 2)适用常规方法难以检测的农药; 3)适用环境监控.
(4)人工免疫抗原的合成
首先将半抗原活化，然后通常是在条件温和 的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合。 如半抗原分子含有羧基，可用碳二亚胺法或 混合酸酐法，如具有羟基活性基团则采用琥珀酸 酐法.
(5)农药抗体制备
农药抗体是经由小分子农药与大分子载体偶 联后的复合物免疫动物使机体产生抗农药的抗体， 并取其免疫动物血清，然后进行分离、鉴定其特 异性而得到的。农药抗体的产生一般可采用两种 途径.
(3)半抗原的制备
抗原是指一切能刺激机体产生抗体和致敏淋 巴细胞，并能与之结合发生特异性免疫反应的物 质。 抗原具有免疫原性和反应原性。 免疫原性是指能刺激机体产生抗体或能诱导 机体产生免疫应答反应； 而反应原性是指能与其诱导产生的抗体或致 敏淋巴细胞进行反应的特性。 既具有免疫原性反又具有反应原性的抗原称 为完全抗原, 而只具有反应原性而没有免疫原性 的抗原称为不完全抗原,也称半抗原.
(1)乙酰胆碱-溴百里酚蓝显色; (2) 乙酸-β-萘酯-固蓝B盐显色反应; (3)乙酸羟基吲哚显色法; (4)乙酸靛酯显色法;
6.1.5 检测方法 (1)比色法: 我国农业部农药检定所利用酶抑 制产生的显色反应,通过分光光度计比色测 定酶的抑制率,以测定有机磷和氨基甲酸酯 类农药残留量.
(2)酶片法: 酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其他敏感酶 类的滤纸或类似载体物质. (3)固相酶速测技术
6.3 生物传感器在农药残留检测中的应用
6.3.1 生物传感器的原理 生物传感器是指由一种生物敏感部件与转换 器紧密配合,对特定种类物质或生物活性物质具有 选择性和可逆响应的分析装置. 传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目 标分析物之间,如酶与底物,抗原与抗体,外源凝集 素与糖,核酸与其互补片段之间的识别反应会产生 一些物理化学信号的变化,这些变化通过不同原理 的传感器转换成第二信号,经放大后显示记录.
6.3.2 电化学生物传感器测定农药残留
生物传感器中信号的测量主要有电化学和光 化学两种.电化学生物传感器可分为电位型和安培 型两种.
6.3.3免疫传感器
是利用抗体与抗原之间的免疫化学反应.
6.2 免疫检测技术
6.2.1免疫分析概述 当细菌、病毒和有害物等病原入侵时,能产生 抵御外来物的抗体，这就是动物的免疫反应，致 病的外来物称为抗原。 免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性 结合反应为基础的分析技术。
6.2.2酶联免疫吸附测定法(ELISA)
原理是在测定过程，样品提取液中的农药与 已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。 为了观察测定结果，往往加入底物和显色剂， 以产生颜色变化。根据样品颜色和标准物质颜色 的吸光度之差就可计算出样品中农药的含量. 农药残留免疫分析方法的建立，一般包括待 测农药的选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗 体制备和样品前处理方法等几个步骤.