原位杂交技术与质量控制

酶作用时间不足（100X FISH）
处理不到位，背景着色很重（100X FISH）
组织问题（100X FISH）
酶处理不足，信号弱（20X）
第二部分
原位杂交技术的质量控制
人员要求
◆有强烈的责任心 ◆具备资质 ◆掌握实验原理
建立实验室管理制度
◆试剂管理 ◆仪器设备管理 ◆实验室人员准人制度 ◆实验室质控制度
核酸杂交的过程
核酸分子杂交
Northern印迹杂交
什么是原位杂交技术？
原位杂交技术是将分子杂交与组织化学相 结合的一种技术，它是利用特定标记的已 知序列核酸与细胞或组织切片中核酸进行 杂交，从而对待测核酸进行精确定量定位 的过程 。
临床病理应用最多的原位杂交技术
荧光原位杂交（FISH）
显色原位杂交
显色原位杂交原理
未标记探针 半抗原 标记物 标记探针 靶核酸 杂交体
+
半抗原特异 性标记抗体
+
显色
+
显色原位杂交在病理诊断中的应用
◆EBV病毒检测，有助于鼻咽癌等与EBV病毒相关疾病的 辅助性诊断 ◆人类乳头状瘤病毒检测，有助于尖锐湿疣和HPV感染 疾病的辅助诊断。
荧光原位杂交原理
荧光原位杂交在病理诊断中的应用
探针浓度 温 PH 时 度 值 间
（1）杂交液

钠盐（杂交效率↑，非特异反应↓） 甲酰胺（使杂交所需温度降低） 硫酸葡聚糖（提高探针有效浓度） 牛血清白蛋白及载体DNA或RNA（阻断探针与组织非特
异性结合，背景↓）
（2）

探针的浓度
探针浓度影响杂交反应的速率 放射性标记探针0.5µg/ml 非放射性标记探针2.0µg/ml 过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反而导致高背
◆乳腺癌：Her-2基因扩增检测，指导赫赛汀用药 ◆胃癌：Her-2基因扩增检测 ◆宫颈病变：TERC基因检测，辅助宫颈病变的分级 ◆膀胱癌：检测3、7、17号染色体及9p21 上的着丝点 ，适用于尿路上皮癌的鉴别诊断、早期诊断、术后评 估、复发预测及监测。
原 位 杂 交 技 术 的 实 验 方 法
实验所需仪器设备
原位杂交仪
荧光显微镜
恒温水浴锅
通风橱
立式染色缸
操作流程简图
◆ 制备的质量 ◆ 新鲜程度

改变细胞膜的通透 性利于探针杂交 酶消化、稀酸处理
Biblioteka Baidu

变性 杂交 洗涤 显色

石蜡组织制备流程简图
2~3% APES丙酮 液体

4μm切 片、裱片
60℃烤片 2-4h
将载玻片涂胶

增加组织与 胶片的粘附
显色原位杂交杂交前处理流程简图
FISH杂交前的预处理流程简图
核酸杂交实验流程简图
切
片
滴 加 探 针
盖 上 盖 玻 片
橡 皮 胶 封 口
把保湿卡放进杂交仪、开机
影响结果的一些因素

标本形态结构 杂交前组织处理 杂交条件 杂交后处理 显色
1.标本形态结构

景染色等不良反应。
（3） 杂交温度

杂交温度应低于杂交体Tm 值的20～30℃； Tm值：使核酸的融解温度，是一半双链分子解链时的 当杂交液含50%甲酰胺、盐浓度0.75mol/L时，杂交温 对DNA探针是35-42℃ 对RNA探针是50-55℃ 对寡核苷酸探针是37℃
温度；

度：
Tm值：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围 内，双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的解链温度，又称 熔解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正 比。
（4）PH值

PH值在5~9之间，杂交体的形成不受影响 常用缓冲液PH值为6.5~7.5
（5）时间

一般探针浓度下，杂交反应在4—6小时完成； 孵育6小时后-杂交信号不再增强； 反应超过24小时后-已形成的杂交体可能发生解链，杂 交信号反而减弱。
4.杂交后处理
◆包括一系列不同温度、不同浓度盐溶液的处理 ◆遵循的原则：温度由低到高、盐浓度由高到低 ◆注意事项：洗涤过程中不能干片
原位杂交技术与质量控制
成都军区昆明总医院病理科 黎贵芸
第一部分 原位杂交技术
分子生物学
新 技 术
组织化学
细胞学
原 位 杂 交 技 术
原位杂交技术的发展
什么是核酸？
碱基之间的结合 ——氢键维系
DNA变性复性的过程
去除变 性条件
探针
一段已知序列的多聚核苷酸
核酸探针
用同位素、生物素或荧光染料等 标记后制成
标记物 3 ’
A C T G T A A T C G G C G C G C A C G T A T T A A T G C C G G C A T T A C G C G
5 ’
5 ’
3 ’
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 来源不同的两条单链核酸分子通过碱 基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分 子杂交。
制定标准操作规程
◆仪器设备使用标准操作规程； ◆EBER1/EBER2原位杂交技术标准操作规程； ◆HPV（低危6/11型、高危16/18型）原位杂交技术 操作标准规程； ◆荧光原位杂交技术标准操作规程；
5.显色
◆荧光原位杂交主要是用DAPI复染剂，滴加前一定要 等组织片上的酒精挥发完全，滴加后15min观察； ◆显色原位杂交用DAB进行显色，显色液浓度要适宜， 显色过程中不能干片，苏木素复染是颜色不宜过深
人体乳头状瘤病毒感染
EBV病毒感染
HER-2基因扩增
Her-2基因无扩增
酶作用时间过长，细胞轮廓不清（100X FISH）
取材：组织大小不能超过包埋盒的1/3。 固定：为了保证结果的准确性，组织离体后，应立即 用10%福尔马林液固定，固定要充分，时间在2-6h， 固定不足或过固定均为造成DNA的降解。
2.杂交前组织处理

增强组织通透性 去垢剂洗涤 酶消化处理

减低背景着色 稀酸处理 预杂交
3.杂交条件
杂 交 液
杂 交 条 件