生物大分子的分离纯化技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶的结 构和性质
凝胶的机械强度、弹性、 透明度和黏度等取决于凝 胶的总浓度:
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聚丙烯酰胺凝胶电泳(2)
凝胶电泳的装置 柱型(Column Gel):
10cm×6cm
板型(Slab Gel):
12cm×12cm或14cm×16cm; 玻璃板间距1.75或1.5 cm.
悬挂吊桶式
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离心(2)
离心力和相对离心力(Relative centrifugal force)：
F=mω2r; Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
沉淀速度与沉降系数：
F摩擦=fv F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒
的沉降速度）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于 1×10-13到200×10-13秒的范围. 以1×10-13s 为一个单位, 称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
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样品的类型、采集与保存
样品的采集 血样：
全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml) 血浆：2000g离心10min 血细胞： 血清：5~30 min自凝分离
尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH<2.5)，
碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）
唾液： 组织样品：液氮等冷冻
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酶样品的准备
酶活性的保持
微过滤技术的应用:
溶液的澄清 微量沉淀物的收集 细菌细胞的收集
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盐析
基本原理：
在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而 增加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度 不断降低而沉淀析出，即盐析。
盐析实验应注意的问题：
盐类的选择：硫酸铵 （767g/l, 25℃)
盐的饱和度：
温度：室温或4℃
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DNA分子量的测定
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仪器
高效毛细管电泳
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毛细管: I.D,25~100μm;O.D.,100~400μm; L, 0.1~1 m 进样系统: nL~pL, 流体力学方法和电动进样 高压直流电源：30kV, 1~300μA 检测
紫外-可见吸收法 荧光检测法 电化学检测法 质谱法
毛细管凝胶电泳
（Capillary Gel Electrophoresis, CGE)
毛细管等电聚焦
（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)
pH：等电点
蛋白质的浓度：
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冷冻干燥
基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下
进行干燥的方法。 冷冻干燥的条件：温度，-10~-40℃；真空度，
13~40 Pa。
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离心
基本原理 种类：
普通离心机（6000rpm)， 高速离心机(25000 rpm)， 超速离心机
转子：固定角度式，
纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液: 水, 缓冲液, 高分子的浓溶液
Donnan效应: pH变化
(勤换透析液,使用大量的透析液)
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Donnan效应:
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微过滤
微过滤的类型:
深层滤器(Depth Filter) : 滤膜滤器(Screen Filter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)
生物大分子的分离纯化技术
生物样品的特点: 生物活性 复杂性
内容: 生物样品的常规分离纯化方法 临床及生化分析样品的预处理 生物大分子的电泳分离纯化技术 生物大分子的色谱分离纯化技术
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生物样品的常规分离纯化方法 透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
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透析
基本原理
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤 维素(Cellulose)
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (盘状电泳) 电荷效应 浓缩效应 分子筛效应
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不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
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聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
1% SDS+ 0.1 M 巯基乙醇 分子量1.0×104~2.0×105
蛋白质的等电聚焦(Isoelectric Focusing, IEF) 原理 pH梯度的形成与保持
电泳分离纯化技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 高效毛细管电泳
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电泳分离纯化技术
基本原理
V=μe E
(μe 为电泳迁移率,即电场强度为1 V/cm 时的迁移速率.)
影响电泳分离的因素:
物质本身的结构和性质: 荷电性质, 形状 支持介质: 吸附作用,电渗作用
溶液介质: pH, 离子强度 电场强度: 常压 精5品0课0件V
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琼脂糖凝胶电泳
特点：
适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好 胶浓度：0.5%~3%；分离1~9.0×107DNA片段
0.5~1.0% 胶分离0.5~30 kb DNA, 1.0~1.5% 胶分离小片段
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琼脂糖凝胶电泳的应用
限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析 DNA超螺旋结构的鉴定 DNA分子量的测定 脉冲场凝胶电泳
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பைடு நூலகம்
高效毛细管电泳
基本概念： 电泳淌度 电渗流
分析参数： 淌度和迁移时间 分离效率 分离度
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高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE)
毛细管胶束电泳
（Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography, CEKC)
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离心(3)
离心技术的类型：
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary) 超速离心法
移动区带(Moving Zone)超速 离心法
等密度方法(Isodensity)：
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临床及生化分析样品的预处理
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
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样品的类型、采集与保存
样品的类型：
控制纯化过程中的pH、温度及有机试剂
加入载体蛋白防止酶的吸附，如: BSA
加入辅助因子保护活性部位, 如: EDTA,巯基乙醇，谷胱
甘肽
抑制蛋白酶的水解作用，如: 氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）
肽等
酰-亮-亮-精三
亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等
样品制备
从组织或器官制备样品 从组织或器官培养液中制备样品 从生物体液中制备样品精品（课件5000 rpm,15 min) 从细胞培养液制备样品