第二章-细胞的分离与破碎-2
第2章 细胞分离与破碎
BIOSEPARATION ENGINEERING
另外，向含菌体的料液中加入聚丙 另外，向含菌体的料液中加入聚丙 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝 剂，可使菌体之间产生架桥作用而 形成较大的凝聚颗粒。 形成较大的凝聚颗粒。 凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降， 而且还可以在过滤分离中大大提高 过滤速度和质量。 过滤速度和质量。当培养液中含有 蛋白质时． 蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而 同时过滤除去。 同时过滤除去。
1）对滤液进行絮凝或凝聚预处理，改变料液性质 2）在料液中加入助滤剂（如硅藻土）
2 细胞破碎
概述： 概述：
BIOSEPARATION ENGINEERING
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞 外的培养液中，而保留在细胞内。 外的培养液中，而保留在细胞内。 这类生物产物需用上节所述方法收集菌体或细 胞后，进行细胞破碎(cell disruption)，使目 胞后，进行细胞破碎 ， 标产物选择性地释放到液相中。 标产物选择性地释放到液相中。 破碎的细胞或其碎片利用上节所述的固液分离 方法(主要是离心法 除去后， 主要是离心法)除去后 方法 主要是离心法 除去后，上清液用于进一 步的分离纯化。 步的分离纯化。
BIOSEPARATION ENGINEERING
1.3 过滤
利用薄片形多孔性介质(如滤布)截留固液悬 浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法 过滤是一种膜分离法
BIOSEPARATION ENGINEERING
滤液的透过阻力主要来自于：过滤介质和介 质表面堆积的滤饼 滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素 提高过滤速度方法：
BIOSEPARATION ENGINEERING
细胞破碎和生化分离技术-PPT
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工 业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了 许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效 率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机 转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数 和相对分子量测定等。
《生化分离工程》教案
第三节 细胞破碎
1固-液分离设备及其特点（重点）（35min）
2细胞破碎概述细胞壁的结构和化学组成（10min）
3常用的细胞破碎方法（重点）及其原理（难点）、机械破碎法所用设备（30min）
4细胞破碎率的测定（5min）
5细胞破碎研究方向（5min）
6小结及思考题（5min）
3滤饼的重量比阻rB
教后小结
学生对絮凝以及凝聚概念有清楚的理解，对发酵液的预处理基本掌握。
教案1
课时安排
4学时
教学次序
第3次课
授课题目
第二章细胞分离与破碎
第三节细胞破碎
1固-液分离设备
2细胞破碎概述细胞壁的结构和化学组成
3常用的细胞破碎方法及其原理、机械破碎法所用设备
4细胞破碎率的测定
5细胞破碎研究方向
2.严希康著，《生化分离工程》，化学工业出版社，北京，2001年2月
3.孙彦著，《生物分离工程》，化学工业出版社，北京，2005年3月
4.欧阳平凯，胡永红著，《生物分离原理及技术》，化学工业出版社，北京，2006年2月
5.谭天伟著，《生物分离技术》，第二版，化学工业出版社，北京，2007年8月
6.朱志强著，《超临界流体萃取技术原理》，化学工业出版社，北京，2001年8月（2）相关专业网站：
小木虫学术科研第一站：/
食品伙伴网：/
食品商贸网：/
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食品科技网：/
教学难点
凝聚和絮凝的区别、滤饼的重量比阻rB
教学方法
讲授法、谈话法。多媒体辅助教学。
教学过程设计
第二章细胞的分离与破碎
第一节发酵液的预处理第二节固液分离
1发酵液预处理的目的（15min）和具体方法（重点30min）
生物分离工程 第二章
细胞分离与破碎
（2）珠磨
影响因素：搅拌速度、停留时间、微珠粒径、细胞本身 适用对象：绝大多数微生物细胞
2
细胞分离与破碎
（3）喷雾撞击破碎
喷雾撞击破碎器结构简图
特点：细胞破碎程度均匀，可避免过度破碎，适用 于细胞器（线粒体、叶绿体等）的回收 适用对象：大多数微生物细胞和植物细胞
2
细胞分离与破碎
（4）超声波破碎 机理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的 形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞 破碎。 影响因素：细胞种类，细胞浓度，频率、功率 适用对象：多数微生物细胞
物理渗透法
（1）渗透压冲击法
（2）冻结-融化法
2
细胞分离与破碎
2.2.4 目标产物的选择性释放
细胞破碎的目的是使胞内的目标产物释放出来，以 进行进一步的分离纯化，因此，理想的破碎方法应当是
使目标产物尽可能多的释放出来，而杂质成分尽可能少 得释放。 ① 仅破坏或破碎目标产物的周围。
① 选择性溶解目标产物。
Rc
W
A
kp
m
一般需缓慢增大操作压力，最终操作压力不超过 0.3 ～ 0.4MPa。
2
细胞分离与破碎
2.1.3.2
过滤设备
工业上常用的过滤设备：加压叶滤机、板框过滤机、 转鼓真空过滤机。
加压叶滤机
转鼓真空过滤机
2
细胞分离与破碎
板框过滤机
2
细胞分离与破碎
2.2 细 胞 破 碎
2.2.1 细胞结构
不同生物细胞，其细胞结构差异很大。
2.2.2 细胞破碎和产物释放原理
摩擦力、撞击作用力、剪切力、化学溶解、酶解
渗透作用力等。
《生化分离工程》思考题及答案
《生化分离工程》思量题及答案第一章绪论1、何为生化分离技术？其主要研究那些内容？生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。
2、生化分离的普通步骤包括哪些环节及技术？普通说来，生化分离过程主要包括 4 个方面：①原料液的预处理和固液分离，常用加热、调 PH、凝结和絮凝等方法；②初步纯化(提取)，常用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作；③高度纯化(精制)，常选用色谱分离技术；④成品加工，有浓缩、结晶和干燥等技术。
3、生化分离工程有那些特点，及其重要性？特点： 1、目的产物在初始物料(发酵液)中的含量低； 2、培养液是多组分的混合物，除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物(几百上千种)、培养基成份、无机盐等； 3、生化产物的稳定性低，易变质、易失活、易变性，对温度、pH 值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感； 4、对最终产品的质量要求高重要性：生物技术产品普通存在于一个复杂的多相体系中。
惟有经过分离和纯化等下游加工过程，才干制得符合使用要求的产品。
因此产品的分离纯化是生物技术工业化的必需手段。
在生物产品的开发研究中，分离过程的费用占全部研究费用的 50％以上；在产品的成本构成中，分离与纯化部份占总成本的 40~80％；精细、药用产品的比例更高达 70~90％。
显然开辟新的分离和纯化工艺是提高经济效益或者减少投资的重要途径。
5、为何生物技术领域中往往浮现“丰产不丰收”的现象？第二章预处理、过滤和细胞破碎1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速率；出去大部份可溶性杂质，并尽可能使产物转入便于以后处理的相中(多数是液相)，以便于固液分离及后提取工序的顺利进行。
：①加热法。
升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用于粘度随温度变化较大的流体。
控制适当温度和受热时间，能使蛋白质凝结形成较大颗粒，进一步改善发酵液的过滤特性。
第02章 生物制品制备的一般步骤
方法：离心、膜过滤、自然沉降。
目的：将细胞碎片或未充分破碎的组织等杂质去掉。 （三）目的产物的分离纯化 除去可溶性杂质，同时富集目的产物的过程，称之为分
离纯化。这是生物制品制备的核心。
方法：沉淀技术、离心技术、过（超）滤技术、层析技术、 萃取技术、电泳技术等，是生物制品制备的常用技术。 但应注意，生物分子千差万别，不同的目的产物，由于其 物理、化学性质不同，生物学特性迥异，因此没有一个方法适 合于任何生物制品的分离纯化
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
凝胶过滤法： 又称分子筛层析法
分子筛层析示意图
蛋白质洗脱体积与分子量的关系
将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱 体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。 待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后 根据标准曲线计算其分子量。
四、蛋白质提取、纯化的一般步骤
1.选材： 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 原则：原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理 和提取。 2.生物材料的破碎和预处理：常用的方法有组织匀浆法、
研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎等。
目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成 分分离。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3.粗分离：将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、
离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确
估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验重复性 较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果有较大的影响。
三、蛋白质提取、纯化前的准备
在进行蛋白质的制备前，通常需要对以下几方面的内容加
以确定或预先了解。 ①明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物 质。 ②通过文献调研和预备性实验，掌握目的蛋白质的理化性 质和生物学特性。如分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热 稳定性；对配体分子的生物学亲和力等。 ③建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备蛋白质的关 键。 ④确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程， 要求具有很高的综合知识和实验技术水平。
生化分离技术 细胞破碎分离
细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离
原料液 原料液
细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 路线一 路线二 清液－胞外产物
路线一A
粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 )
通过改变微生物生长环境（温度、pH、缓 冲液），可以诱发产生自溶酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。
缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
（2）物理法
渗透压冲击法 冻结-融化法 干燥法
①渗透压冲击法
将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定 浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作 用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩， 当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞
之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，
释放出内含物。
WSK卧式高效全能珠磨机
②影响珠磨法破碎的因素
破碎作用公式：
ln[1/(1-R)]=Kt
R — 破碎率；K— 一级反应速度常数； t—时间。 K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环 速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及 温度等相关。
②影响珠磨法破碎的因素
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质 和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次 生壁一般较厚 (4μm以上 ) ，常有三层组成。
n
在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初 生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更 紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。
二
生物分离工程第二章细胞破碎
常用离心设备
Decanter centrifuge
Multichamber bowl, vertical cut
管式离心设备
A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraper
Tubular bowl
碟片离心设备
fg fS fb
则
v
2 g
4 3
S
L
L
d
p
g
重力沉降理论
当球形颗粒处于滞流区（103 Re 1 ）时 Biblioteka 24Revg
d
2 p
S
L g
18 L
Stokes公式
当球形颗粒处于过渡区（1 Re 103 ）时
10
Re 0.5
vg
0.27
操作过程区带离心种类?差速区带离心速度区带离心平衡区带离心等密度离心?平衡区带离心等密度离心差速速区带离心差速区带离心?基于颗粒的大小形状的分离?梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度?离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等?动态离心分离方法平衡衡区带离心平衡区带离心?梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度?离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度离心过程中颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等?平衡离心分离方法梯度液的种类和应用细胞分离区带离心异同区带离心种类差速区带离心平衡区带离心共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质梯度介质常用蔗糖常用蔗糖常用氯化铯常用氯化铯密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降样品最大的密度梯度大于最大密度的沉降样品区带形成条件根据各个组分沉降系数的差别形成各自的区带根据各组分密度差形成区带离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止短时间低速度使各组分沉降到其平衡的密度区长时间高速度离心方法新进展具体表现在哪几个方面
生物分离工程总复习题
生物分离工程总复习题第一章绪论复习题1.生物分离工程在生物技术中的地位？在生物技术领域，通常将生物产品的生产过程称作生物加工过程，包含优良生物物种的育种、基因工程、细胞工程、生物反应过程（酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养等）及目标产物的拆分提纯过程，后者又称作下游加工过程。
生物产物的特殊性、复杂性和对生物产品要求的严格性。
因此导致下游加工过程的成本往往占整个生物加工过程成本的大部分。
生物拆分工程研究的根本任务：设计和优化拆分过程，提升拆分效率，增加拆分过程步骤，延长拆分操作方式时间，达至提升海口收率与活性、降低生产成本的目的。
生物拆分工程的特点就是什么？1．产品丰富产品的多样性导致分离方法的多样性2．绝大多数生物分离方法来源于化学分离3．生物分离一般比化工分离难度大3.生物拆分工程可以分成几大部分，分别包含哪些单元操作方式？生物拆分过程通常分后四步：1.固-液拆分（不溶物的除去）Vergt、过滤器、细胞碎裂目的就是提升产物浓度和质量2.铀（杂质斯维恰河）离子交换吸附、萃取、溶剂萃取、反胶团萃取、超临界流体萃取、双水相萃取以上分离过程不具备特异性，只是进行初分，可提高产物浓度和质量。
3．纯化色谱、电泳、结晶以上技术具有产物的高选择性和杂质的去除性。
4．精制结晶、干燥在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？（1）产品价值（2）产品质量（3）产物在生产过程中发生的边线（4）杂质在生产过程中发生的边线（5）主要杂质独有的物化性质就是什么？（6）相同拆分方法的技术经济比较上述问题的考虑将有助于优质、高效产物分离过程的优化。
5.生物分离效率有哪些评价指标？目标产品的浓缩程度――浓缩率m2．目标产物的拆分提纯程度――拆分因子或拆分系数α3．回收率rec第二章细胞分离与破碎复习题1．简述细胞破碎的意义一、细胞破碎的目的由于存有许多生化物质存有于细胞内部，必须在提纯以前将细胞碎裂，并使细胞壁和细胞膜受相同程度的毁坏（减小通透性）或碎裂，释放出来其中的目标产物，然后方可展开抽取。
生物分离工程第二章
此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs
为
s
2
2
d
2 P
(
S
9 L
L)N 2r
或
s
dr dt
Sr
2.N
12
即：
vs dP 2 (S L ) r 2 18 L
13
提高离心沉降速度的主要措施
vs dP 2 (S L ) r 2 18 L
d － 颗粒直径； ρS － 固体颗粒密度； ρL －液体介质密度； µL－ 液体介质粘度； ω －旋转角速度； r －转轴中心到颗粒中心距离
第二章 细胞分离与破碎
1
总体学习目的和要求
通过本章学习，要求掌握细胞分离 和目标产物释放的原理和方法，熟知各 种方法的优缺点和应用范围。
2
固液分离的目的
• 收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物 （细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和 它们的絮凝体等）。
• 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。
7
子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团 – 引入外力
8
离心沉降
• 离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋转， 在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度 差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而 使颗粒和流体分离。
9
应用
• 1878年 瑞典 牛奶——奶油 • 1896年 用于回收酵母 • 离心分离技术在生工方面主要用于：分
干燥 处理
珠磨法 撞压击榨法 高
压 匀 浆
超 酶溶法 声 破 碎
溶胞 作用 化学法 物理法
44
四、细胞破碎方法及其原理
机械破碎 物理破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
生物分离课后习题
第一章绪论1、何谓生物分离技术？2、生物分离技术特点的特点是什么？3、生物分离技术可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？4、在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？5、简述生物分离工程的发展动向。
第二章细胞分离与破碎1、何谓过滤、沉降；沉降与离心的异同？2、简述过滤的基本形式。
3、凝聚和絮凝的区别有哪些？4、简述过滤、离心设备的分类及其特点。
5、简述细胞破碎的意义。
6、常用细胞破碎方法有哪些？第三章萃取1、液－液萃取的分类？2、何谓萃取的分配系数？其影响因素有哪些？3、什么是乳化现象，其产生原因是什么；如何消除乳化现象？4、何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？5、何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？其成相机理如何？6、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理第四章膜分离1、什么是膜？2、简述膜分离技术的分类3、基本的膜材料有哪些？4、常用的膜组件有哪些？5、何谓反渗透？实现反渗透分离的条件是什么？6、电渗析的工作原理？第五章吸附与离子交换1、什么是吸附过程？吸附的类型有哪些？它们是如何划分的？2、什么是吸附等温线？其意义何在？影响吸附过程的因素有哪些？3、什么是亲和吸附？其特点有哪些？4、什么是离子交换？离子交换的机理是什么？5、什么是离子交换树脂的交换容量，如何测定？6、基本的离子交换操作是怎样的？7、什么是离子交换的选择性？其选择性受哪些因素影响？第六章结晶1、结晶操作的原理是什么？2、饱和溶液和过饱和溶液的概念3、结晶的一般步骤是什么？4、过饱和溶液形成的方法有哪些？5、绘制饱和温度曲线和过饱和温度曲线，并标明稳定区、亚稳定区和不稳定区。
6、常用的工业起晶方法有哪些？7、重结晶的概念第七章干燥1、干燥的概念2、干燥的基本流程3、物料中所含水分的种类有哪些？平衡水分和自由水分的概念4、了解干燥曲线，并结合干燥速率曲线说明恒速干燥阶段和降速干燥阶段的特点5、干燥设备选型的原则是什么？6、常用的干燥设备有哪些？其特点是什么？友情提示：部分文档来自网络整理，供您参考！文档可复制、编制，期待您的好评与关注！。
细胞的分离和破碎
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CONTENTS
2.1 发酵液的预处理
壹
请在此添加较简洁标题内容
贰
请在此添加较简洁标题内容
去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作 杂质中影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等
预处理的具体方法
高价无机离子的去除方法
去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解
度较小，不适合用量较大的场合。
去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。
用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。
去除铁离子: 加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。
杂蛋白质的除去 沉淀法 盐析 调节pH→pI 吸附法 加入吸附剂或沉淀剂 变性法 加热，大幅度调节pH，加有机溶剂或表面活性剂等。
胶体双电层的构造
絮凝
指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大（10mm）的絮凝团的过程。
絮凝剂的分类
根据活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。 根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类：
絮凝效果与絮凝剂的分子量和类型、加量，溶液的pH，搅拌速度和时间等因素有关。
3. 机械破碎法与非机械法的比较
比较项目
机械法
非机械法
破碎机理
切碎细胞
溶解局部壁膜
碎片大小
细小
较大
内含物释放
全部
部分
黏度
高（核酸多）
低（核酸少）
时间，效率
时间短，效率高
生化分离工程教案
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食品工业网：.food.hc360./
食品科技网：.tech-food./
食品安全网：.tech-food./
中国绿色食品网：./sites/MainSite/
教学过程设计
第三章 细胞的分离与破碎
第三节 细胞破碎
1 固-液分离设备及其特点（重点）（35min）
2 细胞破碎概述 细胞壁的结构和化学组成（10min）
3 常用的细胞破碎法（重点）及其原理（难点）、机械破碎法所用设备（30min）
4 细胞破碎率的测定（5min）
5 细胞破碎研究向（5min）
6小结及思考题（5min）
2.希康著，《生化分离工程》，化学工业出版社，北京，2001年2月
3.彦著，《生物分离工程》，化学工业出版社，北京，2005年3月
4.欧阳平凯，永红著，《生物分离原理及技术》，化学工业出版社，北京，2006年2月
5.谭天伟著，《生物分离技术》，第二版，化学工业出版社，北京，2007年8月
6.志强著，《超临界流体萃取技术原理》，化学工业出版社，北京，2001年8月（2）相关专业：
审阅人（签字）： 年 月 日
课时安排
2学时
教学次序
第1次课
授课题目
第一章绪论
1 生物技术下游加工过程的基本定义和特点、一般步骤
2 生化分离技术的发展历程
3 生物技术下游加工过程的选择准则、发展动向及分离效率的评价
教学目标
通过绪论的学习，使学生重点掌握生物技术下游加工过程的基本定义、特点和一般步骤，了解生离效率的评价。
3.彦著，《生物分离工程》，化学工业出版社，北京，2005年3月
第二章_细胞破碎技术
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖占 40 ％一 90％，其余是多糖和磷壁酸。 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，最外面还有一 较厚的外壁层，外壁层主要由脂蛋白，脂多糖 组成。
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取决 于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的 程度，如果交联程度大，则网结构就致密。
W S K 卧 式 高 效 全 能 珠 磨 机
ZM 系 列 卧 式 密 闭 珠 (砂) 磨 机
（三）超声破碎法 工作原理：利用超声波振荡器发射的1525kHz的超声波处理细胞悬浮液，由于超 声波的空化作用而使细胞破碎。 特点：超声波振荡容易引起温度的剧烈 上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入 冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。
二、植物细胞
真核细胞具有真正的细胞核，其结构要比 原核生物复杂的多。和原核细胞一样，真 核细胞也具有一层细胞膜。 除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作 用的细胞器。 植物和大多数真菌具有细胞壁。
动 物 细 胞 模 式 图
植 物 细 胞 模 式 图
对于已停止生长的植物细胞来说，其细胞 壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁 是细胞生长时期形成的。次生壁是细胞停 止生长后，在初生壁内部形成的结构。
一、微生物细胞
细胞外层结构
革兰氏阴性菌（Gram-negative），泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。葡萄 球菌、链球菌。 革兰氏阳性菌（Gram Positive）是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌。 大肠杆菌。
各种微生物细胞壁的结构及组成
微生物 壁厚（nm） 层 革兰式阳性菌 革兰式阴性菌 酵母 20～80 单层 肽聚糖(40~90%) 多糖 胞壁酸 主要组成 蛋白质 脂多糖 破碎难易程度 难 10～25 100～300 多层 多层 肽聚糖(5~10%) 葡聚糖(30~40%) 脂蛋白 甘露聚糖 （30％） 脂多糖 磷脂 蛋白质 蛋白质 脂类 相对易 最难
生物分离工程(孙彦)1-4章部分答案
加入原点对Q2-t 做线性回归，比不包括原点时回归数据的相关度增加了。
第二章 细胞分离与破碎
方法三： 二次回归：
利用二次回归所得拟合方程最为精确，也为恒压过滤中介质比阻可以忽略提供依据
第二章 细胞分离与破碎
2.3
第二章 细胞分离与破碎 – 第二次作业
第二章 细胞分离与破碎
2.4 (式2.44a)
得
log 0.26 K S 9.0 （2） 由（1 ）和（2）解得：K S 1.107, 9.378 所以Cohn方程为： log S 9.378 1.107 I
第三章 初级分离
当C3＝3.5 mol时， I 3＝1/ 2 （2 3.5 1 ＋3.5 2 ）
第三章 初级分离
3.4
（式3.13-式3.15）
第三章 初级分离
( 2)沉淀颗粒直径达到 100 m时，假设生长过程中 粒子总体积不变 , 则：＝d 3CN / （式 6 3.19） 3.14 1.125 10 2.84 10 4 P 750 Kg /( m * s ) V P 4 P 1/ 2 [ v ] 759.55,由式C C 0 exp( [ v ]1 / 2 t ) V V 求得：t＝2002.24S 又v 1.3 10 3 Kg /( m * s ),
d (Vc) Qc(1 RT ) dt
① ②
dV Qdt
得：
V0 RT c ( ) c0 V 代入数据得：
5 1000 0.99 ( ) 1 V
V 196.78(m L)
由②积分得：
dV Qdt dV 0.5 dt
V0 0 V t
t
食品分离技术自测题
食品分离技术自测题第一章绪论一名词解释1.平衡分离过程2.速率控制过程二、填空1、食品分离过程是熵的过程，必须外加能量才能进行。
2、食品分离通常来说要达到下列两个目的:,.3、随着社会地发展和技术的进步，工业上形成的分离技术越来越多，但从本质上来说，所有分离技术都可分为和传质分离两大类。
传质分离又分为和4、食品分离技术按分离性质可分为和两大类5、食品分离技术按分离方法可分为、、三、判断题1、分离剂是分离过程的推动力或辅助物质，它包括质量分离剂和能量分离剂。
（）2、机械分离过程的分离对象是有两相组成的混合物。
（）3、单元操作侧重分离方法的共性规律，而分离过程则侧重分离方法的个性规律。
（）四、选择题1、以下不属于传质分离过程的是A过滤B超滤C蒸馏D萃取2、以下不属于平衡分离过程的是A离子交换B色谱C结晶D干燥五、简答题1、分离过程有哪些基本原则？2、食品分离过程特点是什么？3、评价一种食品分离技术的优良，可从哪几方面来考虑？4、简述食品分离技术在食品工业中的重要性。
第二章细胞的破碎与细胞分离一、名词解释凝聚絮凝差速离心分离：离心速度逐渐提高，样品中组分按大小先后沉降。
区带离心分离：借助离心管中的梯度介质，经高速离心将样品中组分分离。
二、选择题1、丝状（团状）真菌适合采用（）破碎。
A、珠磨法B、高压匀浆法C、A与B联合D、A与B均不行2、适合小量细胞破碎的方法是（）A高压匀浆法B.超声破碎法C.高速珠磨法D.高压挤压法3、发酵液的预处理方法不包括（）A.加热B絮凝C.离心D.调pH4、下列物质属于絮凝剂的有（）。
A、明矾B、石灰C、聚丙烯类D、硫酸亚铁5、哪种细胞破碎方法适用工业生产（）A.高压匀浆B超声波破碎C.渗透压冲击法D.酶解法6、高压匀浆法破碎细胞，不适用于（）A.酵母菌B大肠杆菌C.巨大芽孢杆菌D.青霉三、判断题1．细胞破碎时破碎率越大，细胞中大分子目的物得率越高。
（）2．G-菌细胞膜网状结构不及G+菌的坚固，故较易破碎。
生物分离工程期末复习
生物分离工程复习题第一章绪论简答题：1、简述生物分离技术的基本涵义及内容。
答：基本涵义：生物分离技术是指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。
内容主要包括：离心分离、过滤分离、泡沫分离、萃取分离、沉淀（析）分离、膜分离、层析（色谱）分离、电泳分离技术以及产品的浓缩、结晶、干燥等技术。
2、物质分离的本质是有效识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质和扩大这些差别的分离设备实现溶质间的分离或目标组分的纯化。
请从物质的理化性质和生物学性质几个方面简述生物活性物质分离纯化的主要原理。
答：生物大分子分离纯化的主要原理是：1）根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心与超离心、膜分离、凝胶过滤等；2）根据分子电离性质（带电性）差异进行分离，如离子交换法、电泳法、等电聚焦法；3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀及有机溶剂分级沉淀等；4）根据物质吸附性质的不同进行分离，如选择性吸附与吸附层析等；5）根据配体特异性进行分离，如亲和层析法等。
填空题：1.为了提高最终产品的回收率：一是提高每一级的回收率，二是减少操作步骤。
2、评价一个分离过程效率的三个主要标准是：①浓缩程度②分离纯化程度③回收率。
判断并改错：原料目标产物的浓度越高，所需的能耗越高，回收成本越大。
(×)改：原料目标产物的浓度越低。
选择题：1. B 可以提高总回收率。
A.增加操作步骤B.减少操作步骤C.缩短操作时间D.降低每一步的收率2．分离纯化早期，由于提取液中成分复杂，目的物浓度稀，因而易采用（ A ）A、分离量大分辨率低的方法B、分离量小分辨率低的方法C、分离量小分辨率高的方法D、各种方法都试验一下，根据试验结果确定第二章细胞分离与破碎概念题：过滤：是在某一支撑物上放多孔性过滤介质，注入含固体颗粒的溶液，使液体通过，固体颗粒被截留，是固液分离的常用方法之一。
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离心沉降
• 离心类别 • 离心沉降速度 • 离心分离法
• 离心分离设备
离心机的种类和适用范 围
转速 / rpm 离心力 / g 适 细 胞 用 细胞核 范 细胞器 围 蛋白质 低速离心机 2 000～6 000 2 000～7 000 适用 适用 — — 高速离心机 10 000～26 000 8 000～80 000 适用 适用 适用 — 超离心机 30000～120000 100000～600000 适用 适用 适用 适用
物质 细胞色素 C 肌红蛋白 胰蛋白酶 尿酶酶 卵白蛋白 α -淀粉酶 血红蛋白 伴刀豆蛋白 A(四聚体) IgG IgM 相对分子质量 12 400 16 900 28 000 32 000 45 000 50 000 64 550 102 300 150 000 900 000～1 000 000 沉降系数 S w0 , 20 / S 1.18 2.04 2.5 2.7 3.7 4.5 4.1～4.5 6.0 6.0～7.8 18～20
形成分被过滤介质截留，在介质表面形成滤饼。
滤液的透过阻力来自两个方面，即过滤介质和 介质表面不断堆积的滤饼。 2. 提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。 由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因
此在过滤操作以前，一般要对滤液进行絮凝或
凝聚等预处理。改变料液的性质，降低滤饼的
阻力。
过滤设备
出液口
组分的性质和相互作用等)、分离的目的和所需
分离的程度，选择适当的操作条件(离心转数和 时间)，可使料液中的不同组分得到分级分离。
差 速 离 心
2.2.3.2 离心分离法 差速离心是生化工业中常用离心分离方法。以菌体 细胞的收集或除去为目的的固液离心分离，是分级离心 操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。
思考题
1、何谓沉降 2、沉降与离心的异同 3、离心设备可分为哪两大类 4、常用的离心沉降设备有哪些 5、常用的离心过滤设备有哪些
2.2 细胞破碎
胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多 数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行固 液分离，即可进行滤清液的分离。 胞内产物： 某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细 胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。 随着重 组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生，
霉菌 100～250 多层 多聚糖 (80%～90%) 脂 类 蛋白质
主要组 成
2.1.2 细胞破碎原理
细胞破碎方法可分成两大类，一是机械法，二是非机
械法，或是两者的结合。
机械法有珠磨法、高压均质法、超声破碎法、X-press 法等；由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，大多需 冷却以防止生物品受热破坏。非机械法有酶溶法、化学法、 物理法和干燥法等。 机械法中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切 力。 化学破碎利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜 结构，增大胞内物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁后， 在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。
高压匀浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、
循环操作次数和温度。细胞破碎率S与操作压力 P和循环操作次数N之间的关系可表达为
1 a b ln kp N 1 S
细胞破碎率用胞内产物释放率表示,是单位质量
细胞的产物释放量，mg/cell
R S Rmax
高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的 破碎，料液细胞浓度可达到20％左右。团状 和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般不宜 使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度上升 约2～ 3℃／10MPa，为保护目标产物的生物 活性，需对料液作冷却处理，多级破碎操作 中需在级间设置冷却装置。因为料液通过匀 浆器的时间很短，通过匀浆器后迅速冷却， 可有效防止温度上升，保护产物活性。
细胞外层结构
微生物 壁厚 /nm 层次
细菌 革兰氏阳性 革兰氏阴性 20～80 单层 肽聚糖 (40%～90%) 多 糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%～4%) 10～13 多层 肽聚糖 (5%～10%) 脂蛋白 脂多糖 (11%～22%) 磷 脂 蛋白质
酵母菌 100～300 多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂 类 (8.5%～13.5%)
梯度 离心
1. 两种区带离心法均事先在离心管中用某种 低分子溶质(如蔗糖、甘油等溶液)调配好密 度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液 后进行离心操作。 2. 区带离心的密度梯度一般可用蔗糖配制。 事先调配不同浓度(密度)的蔗糖溶液，然后 在离心管中依浓度从大到小层层加入即可。 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速 离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。 3. 区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大 分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限
于实验室水平。
密度梯度离心（density gradient）
生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。
区带离心
区带离心(Zonal centrifugation)是生 化研究中的重要分离手段，根据离心操作条 件不同，分为 1. 差速区带离心(Rate zonal density gradient sedimentation)
2. 平衡区带离心(Isopycnic density gradient sedimentation)
2 d P ( S L ) N r s 9 L
或
dr s Sr dt
2 .N
离心分离法
• 差速离心 • 区带离心
差速离心分级
1. 差速离心(Differential centrifugation)是生化工业
中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集 或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作 的一种特殊情况，即为一级分级分离。 2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他
g
2 d p ( S L )g
18 L
d 上式为球形粒子的Stokes沉降速度， p 、 s、 L 和 g 分别表示粒径、固体颗粒密度、液 体密度和重力加速度， g 为重力沉降速度， L 为液体粘度。
菌体和动植物细胞的重力沉降虽 然简便易行，但菌体细胞体积很小， 沉降速度很慢。因此，实用上需使菌 体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后进行 沉降操作，提高沉降速度。
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞 大小/μ m 2～4 2～7 2～4 6～9 7～12 20～30 离心力 实验室 工业规模 1 500g 13 000g 1 500g 8 000g 5 000g — 1 200g — 500g — 800g —
蛋白质的沉降系数
区带转子
分析转子
各种转子
管式离心机
碟片式离心机
过滤
• 过合适的多孔性过滤介质， 可以过滤截留菌体、细胞和碎片等 悬浮液中的固体离子。 织物状介质，棉花、石棉、蚕丝、
麻、羊毛及各种人造纤维与金属丝等
多孔陶瓷介质，此为特殊的介质，
低温烧制，具有大量微细孔道的滤管或 滤板（其他多孔材料，PE等）
菌(狭义)、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体。
真核细胞 － 含有真核（被核膜包围的核）的细胞。包括动植物以
及微小的原生动物、单细胞海藻、真菌、苔藓等。
动物细胞无细胞壁，只有细胞膜，易于破碎。植物细胞和微生
物细胞的细胞膜外还有一层坚固的细胞壁，破碎较困难。
微生物细胞的细胞壁固定细胞外形，保护细胞免受机械损伤或 渗透压破坏。细胞膜主要由蛋白质和脂质组成，二者之和占细胞膜
预处理--细胞的分离与破碎
2.1 细胞分离
• 重力沉降 • 离心沉降 • 过滤
重力沉降
重力沉降是化工过程中常用的气固、 液固和液液分离手段，在生化分离过程 中亦有一定程度的应用。
以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受 到重力、浮力和摩擦阻力的作用。考虑球形的 固体颗粒，则当浮力、摩擦阻力和重力达到平 衡时，固体颗粒匀速沉降，沉降速度为
3、溶液中核酸构象的研究
：单链DNA双链DNA 蛋白质 双链DNA RNA 4、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心
超螺旋 DNA
经染料-氯化铯密度梯 度超离心后，质粒DNA 及各种杂质的分布
离心分离设备
1. 离心机是生化实验室及生化工业广泛使用 的分离设备。实验室用离心机以离心管式 转子离心机为主，离心操作为间歇式。 2. 工业离心分离设备中，较为常用的有管式 和碟片式两大类。
滴加样品
离 心 管
蔗糖浓度
蔗糖密度梯度
密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用
1、核酸密度的测定
= o + 4.2 2(20
2)10-10
石蜡油 蛋白质 开环质及 线型DNA 闭环质粒 DNA
2、测定DNA中G-C之含量 Rolfe-Meselson公式： = 0.100xG-C + 1.658
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心
力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量
离心程度的参数，用Z表示
4 N r Z g
2 2
式中，r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距 离，N为离心机的转数(s-1) 。
离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因 此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs 为 2 2 2
细胞破碎和产物释放原理
胞内产物释放速率模型
细胞破碎法
• 机械破碎 • 化学和生物化学渗透
• 物理渗透法