第四章 细胞的破碎与分离

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第四章细胞的破碎与分离

教学基本要求:

1. 掌握细胞破碎的概念。

2. 熟悉和掌握细胞破碎的各种方法。

时间安排:3学时。

教学形式:本章以讲授为主,中间部分进行部分提问,采用PPT课件讲课。

教学内容:

由于有许多生化物质存在于细胞内部,必须在纯化以前将细胞破碎,使胞内物质释放到液相中,然后方可进行提取。细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。

破碎率及其测定方法:

破碎率:被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比。

测定方法:直接测定法和间接测定法。

细胞破碎方法分类

1) 机械破碎法(高速珠磨法、高压匀浆法、超声波法等)

2) 非机械破碎法(化学法、酶解法、渗透压法、冻融法、干燥法等)

机械破碎法:

一、固体剪切方法(珠磨):

1、定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程

2、工作原理:固-固剪切力、液-固剪切力等。

3、影响因素:

转盘外缘速度:速度增加,破碎率增加,但功率­,温度­

珠粒添量和大小:要适度

温度:但研磨产热,功率­,温度­。如产物热不稳定,必须控温。

细胞浓度x:最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降,但单位细胞重量的能耗­。

流量Q:破碎为一级反应。Q-, E-,R¯;Q¯,E¯,R-。

二、高压匀浆法(液体剪切方法)

1、定义—利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程

2、工作原理:液-液剪切力、压力差等

3、影响因素:

通过匀浆机的次数

温度:高温使破碎率增加但高温使产物变性

压力:高压使破碎率增加但高压使能耗增加,且会使机器破损。

在大规模cell破碎中,高压匀浆机和珠磨机用得最多; 二者均具有适用对象广,工业化、实验室中应用,细胞完全破碎等优点。高压匀浆机最适合于酵母和细菌;珠磨机可用于酵母和细菌,但对真菌菌丝和藻类更合适。

三、超声波法

1、定义—利用超频率声波(15-25kHz)在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程

2、工作原理:空穴现象,空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。

3、特点:

优点:适合于多种细胞的破碎

缺点:A、影响因素多,如振幅、黏度、表面张力、珠粒体积和直径、被处理悬浮液的体积和流速、探头材料和形状;B、超声产生超氧离子毒害作用;C、有效能量的利用率低;

D、产热大,需控温;

E、不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎。

非机械破碎法

一、化学(脂溶)法:

1、定义——采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性,使内含物有选择性地释放出来的过程。

2、原理:

酸碱:改变溶液pH值,从而改变两性产物蛋白质等的电荷性质

有机溶剂:如甲苯,被细胞壁脂质层吸收后,导致细胞壁膨胀,细胞壁破裂。

表面活性剂:

二、酶解法

1、定义—利用酶促反应分解细胞壁上的化学键而达到细胞破碎的过程

2、原理

外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶(β-1,4、β –1,6)、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等。

内源性酶解(自溶)——温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等。

3、化学法与酶法的优点:

A、产品释放的选择性;

B、提取速度和收效高;

C、产品的破坏小;

D、对外界环境,如pH和温度等要求低;

E、不残留细胞碎片

三、物理法:

1、渗透压法:细胞经高渗溶液,如一定浓度甘油或蔗糖溶液处理,使之脱水收缩,然后转入水或水溶液,因渗透压突然变化,细胞快速膨胀而破裂,使产物释放到溶液中。

2、冻融法:细胞在低温(-15度)下冷冻,然后在室温下融化,反复多次而使细胞破裂。

3、干燥法:细胞用不同的方法干燥,细胞膜渗透性发生改变而破裂。然后用有机溶剂缓冲溶液抽提胞内物质。

四、机械法和非机械法的比较

1、机械法法缺点:

A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高),易使产品变性失活;

B、非专一性,胞内产物均释放,分离纯化困难;

C、细胞碎片大小不一,难分离。

2、非机械法缺点:

A、费用高;

B、引起新的污染,尤其是其他化学方法;

C、一般只有有限的破碎,常需与其他物理法连用。

破碎方法的选择

一、选择的一般原则

1、提取产物在细胞质内,用机械法破碎

2、提取产物在细胞膜附近,用化学法

3、提取产物与细胞膜和细胞壁结合,可采用化学法和机械法结合的方法

二、破碎技术应注意的问题

1、多种破碎方法相结合,杂交技术可产生很大优势。

2、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除,产物的分离纯化

3、破碎技术与上游技术相结合:菌种的培育(过程和环境、胞内产物® 胞外产物)对破

碎难易程度的影响

三、存在的问题

1、包涵体

通过基因工程技术使一些基因在原核细胞表达时,蛋白质常常交联在一起,形成不溶性的聚积物,通常称为包涵体。

2、包含体的解决方法(一般步骤)

1) 包含体的分离:细胞破碎,然后离心。

2) 包含体溶解、变性、还原,一般用尿素、盐酸胍、SDS

3) 变形蛋白质的复性和重新氧化:分子伴侣-催化及维持其它蛋白质正确构象的一类蛋白质分子,它参与许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运输,通过瞬时稳定其它蛋白质折叠中间体,阻止了蛋白质的聚集,帮助其形成正确构象。

4) 一般的分离纯化。

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