第四章 细胞的破碎与分离
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第四章细胞的破碎与分离
教学基本要求:
1. 掌握细胞破碎的概念。
2. 熟悉和掌握细胞破碎的各种方法。
时间安排:3学时。
教学形式:本章以讲授为主,中间部分进行部分提问,采用PPT课件讲课。
教学内容:
由于有许多生化物质存在于细胞内部,必须在纯化以前将细胞破碎,使胞内物质释放到液相中,然后方可进行提取。细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。
破碎率及其测定方法:
破碎率:被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比。
测定方法:直接测定法和间接测定法。
细胞破碎方法分类
1) 机械破碎法(高速珠磨法、高压匀浆法、超声波法等)
2) 非机械破碎法(化学法、酶解法、渗透压法、冻融法、干燥法等)
机械破碎法:
一、固体剪切方法(珠磨):
1、定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
2、工作原理:固-固剪切力、液-固剪切力等。
3、影响因素:
转盘外缘速度:速度增加,破碎率增加,但功率,温度
珠粒添量和大小:要适度
温度:但研磨产热,功率,温度。如产物热不稳定,必须控温。
细胞浓度x:最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降,但单位细胞重量的能耗。
流量Q:破碎为一级反应。Q-, E-,R¯;Q¯,E¯,R-。
二、高压匀浆法(液体剪切方法)
1、定义—利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
2、工作原理:液-液剪切力、压力差等
3、影响因素:
通过匀浆机的次数
温度:高温使破碎率增加但高温使产物变性
压力:高压使破碎率增加但高压使能耗增加,且会使机器破损。
在大规模cell破碎中,高压匀浆机和珠磨机用得最多; 二者均具有适用对象广,工业化、实验室中应用,细胞完全破碎等优点。高压匀浆机最适合于酵母和细菌;珠磨机可用于酵母和细菌,但对真菌菌丝和藻类更合适。
三、超声波法
1、定义—利用超频率声波(15-25kHz)在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程
2、工作原理:空穴现象,空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。
3、特点:
优点:适合于多种细胞的破碎
缺点:A、影响因素多,如振幅、黏度、表面张力、珠粒体积和直径、被处理悬浮液的体积和流速、探头材料和形状;B、超声产生超氧离子毒害作用;C、有效能量的利用率低;
D、产热大,需控温;
E、不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎。
非机械破碎法
一、化学(脂溶)法:
1、定义——采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性,使内含物有选择性地释放出来的过程。
2、原理:
酸碱:改变溶液pH值,从而改变两性产物蛋白质等的电荷性质
有机溶剂:如甲苯,被细胞壁脂质层吸收后,导致细胞壁膨胀,细胞壁破裂。
表面活性剂:
二、酶解法
1、定义—利用酶促反应分解细胞壁上的化学键而达到细胞破碎的过程
2、原理
外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶(β-1,4、β –1,6)、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等。
内源性酶解(自溶)——温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等。
3、化学法与酶法的优点:
A、产品释放的选择性;
B、提取速度和收效高;
C、产品的破坏小;
D、对外界环境,如pH和温度等要求低;
E、不残留细胞碎片
三、物理法:
1、渗透压法:细胞经高渗溶液,如一定浓度甘油或蔗糖溶液处理,使之脱水收缩,然后转入水或水溶液,因渗透压突然变化,细胞快速膨胀而破裂,使产物释放到溶液中。
2、冻融法:细胞在低温(-15度)下冷冻,然后在室温下融化,反复多次而使细胞破裂。
3、干燥法:细胞用不同的方法干燥,细胞膜渗透性发生改变而破裂。然后用有机溶剂缓冲溶液抽提胞内物质。
四、机械法和非机械法的比较
1、机械法法缺点:
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高),易使产品变性失活;
B、非专一性,胞内产物均释放,分离纯化困难;
C、细胞碎片大小不一,难分离。
2、非机械法缺点:
A、费用高;
B、引起新的污染,尤其是其他化学方法;
C、一般只有有限的破碎,常需与其他物理法连用。
破碎方法的选择
一、选择的一般原则
1、提取产物在细胞质内,用机械法破碎
2、提取产物在细胞膜附近,用化学法
3、提取产物与细胞膜和细胞壁结合,可采用化学法和机械法结合的方法
二、破碎技术应注意的问题
1、多种破碎方法相结合,杂交技术可产生很大优势。
2、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除,产物的分离纯化
3、破碎技术与上游技术相结合:菌种的培育(过程和环境、胞内产物® 胞外产物)对破
碎难易程度的影响
三、存在的问题
1、包涵体
通过基因工程技术使一些基因在原核细胞表达时,蛋白质常常交联在一起,形成不溶性的聚积物,通常称为包涵体。
2、包含体的解决方法(一般步骤)
1) 包含体的分离:细胞破碎,然后离心。
2) 包含体溶解、变性、还原,一般用尿素、盐酸胍、SDS
3) 变形蛋白质的复性和重新氧化:分子伴侣-催化及维持其它蛋白质正确构象的一类蛋白质分子,它参与许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运输,通过瞬时稳定其它蛋白质折叠中间体,阻止了蛋白质的聚集,帮助其形成正确构象。
4) 一般的分离纯化。