细胞的破碎与分离包涵体
(整理)包涵体的分离纯化.
包涵体的纯化和复性总结（二）关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体的复性总结
包涵体的复性总结关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题,已经成为生物制药的瓶颈,包涵体的复性前期准备工作尤为重要,关于包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,实验内容比较庞杂、繁琐。
一、菌体的裂解菌体的破碎方法很多:高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂:二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。
在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。
二、包涵体的洗涤通常的洗涤方法一般是难以洗干净的,包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。
根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液,比如:2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0,再用缓冲洗涤一次。
此外,刚处理完的包含体好溶解,冷冻后难溶解,且溶解时间和比例都会加大。
三、包涵体的溶解强的变性剂如尿素、盐酸胍,是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备重组蛋白在大肠杆菌、酵母、哺乳动物中的表达可分为三种形式：胞外分泌表达、胞内可溶性表达和胞内不溶性表达（即产物以包涵体形式存在）。
以包涵体形式存在的重组蛋白是无生物活性的，需要进行复性处理，然后再进行分离纯化。
包涵体纯化与传统生物大分子的分离纯化方法相似，即以分子的等电点、溶解性、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等特征为基础进行纯化。
一、常用的包涵体纯化方法1. 金属亲和层析该方法主要利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和金属离子之间的相互作用来进行蛋白纯化。
我们在载体构建时可以加上一些亲和性标签（如His标签、GST标签、Flag标签等），以便采取亲和纯化的方式纯化蛋白。
利用Ni2+和6×His tag之间的亲和性，通过在蛋白的N端或C端加上6～10个组氨酸，在一般或变性条件下借助它与Ni2+螯合柱的紧密结合能力，采用咪唑洗脱，或降低PH使组氨酸充分质子化，使其不再与Ni2+结合，从而分离纯化出带有6×His tag的融合蛋白，纯度通常能达到90%以上。
2．离子交换层析离子交换层析是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离的方法。
常用的离子交换剂有羧甲基纤维素（阳离子交换剂，弱酸型）和二乙基氨基乙基纤维素（阴离子交换剂，弱碱型）。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，需要通过提高洗脱液中的盐浓度等措施将其洗脱下来。
根据蛋白质结合能力不同，洗脱的速度会存在差异，通常结合较弱的蛋白质先被洗脱。
反之，阳离子交换基质会结合带有正电荷的蛋白质，可以通过提高洗脱液的PH或增加洗脱液中的盐浓度将蛋白洗脱下来。
3．凝胶过滤层析凝胶过滤层析通常又称为分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状达到分离和纯化的目的。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
此方法的优点在于层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷并且吸附力弱，可较广的温度范围内进行。
生化工艺——第二章细胞破碎
²
第二节
细胞壁的破碎
一、珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下， 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相 被破碎。 互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。 破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln = kt 1− x
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低， 特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力； 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。
1 − x = exp( − kt )
影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广； 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大， 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多 在实验室使用。 在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法 机 械 法 技术 原理 效果 成本 举例 动物组织及 动物细胞 匀浆法（片型） 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器 劈碎 研磨法 超声波法 细胞被研磨物 磨碎 用超声波的空 穴作用使细胞 破碎 适中 适中 适中 便宜 适中 昂贵 细胞悬浮液 小规模处理 细胞悬浮液 大规模处理
匀浆法（孔型） 匀浆法（孔型） 须使细胞通过 的小孔， 的小孔，使细 胞受到剪切力 而破碎 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠 或铁珠捣碎
总结 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠 磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细 菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
三、超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用， 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生 使细胞破碎。 极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 ²
包涵体解决办法
2 ）包涵体的分离蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100/ EDTA 或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。
（1）试剂与配制①洗涤液I：0.5 % Triton X -10010 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )溶于细胞裂解液中。
②2×凝胶电泳加样缓冲液。
（2）细胞裂解混合物12 000g 离心，15 min ,4 ℃；弃上清，沉淀用9×洗涤液l 悬浮；室温放置5 min ; 12 000g 离心15 min ,4 ℃；吸出上清，用1 00 μL 水重新悬浮沉淀；分别取10 μL上清和重新悬浮的沉淀，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE 。
3 ）包涵体的溶解和复性（1）试剂与配制①缓冲液I：1 mmol / L PMSF8mol /L 尿素10 mmol / L DTT溶于前述裂解缓冲液中。
②缓冲液Ⅱ：50 mmol / L KH2PO41 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )50 mmol / L NaCI2 mmol / L 还原型谷胱甘肽1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽③KOH 和HCI 。
④2×凝胶电泳加样缓冲液。
（2）用100 μL 缓冲液I 溶解包涵体；室温放置lh ；加9×缓冲液Ⅱ，室温放置30 min ，用KOH 调pH 到10.7 ；用HCI 调至pH 8 .0 ，在室温放置至少30 min ; 1000g 离心，15 min ，室温；吸出上清液并保留，用100 μL 2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀；取10 μL 上清，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，与20 μL 重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE 。
四、注意事项（1）不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。
《生化分离工程》思考题及答案
《生化分离工程》思量题及答案第一章绪论1、何为生化分离技术？其主要研究那些内容？生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。
2、生化分离的普通步骤包括哪些环节及技术？普通说来，生化分离过程主要包括 4 个方面：①原料液的预处理和固液分离，常用加热、调 PH、凝结和絮凝等方法；②初步纯化(提取)，常用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作；③高度纯化(精制)，常选用色谱分离技术；④成品加工，有浓缩、结晶和干燥等技术。
3、生化分离工程有那些特点，及其重要性？特点： 1、目的产物在初始物料(发酵液)中的含量低； 2、培养液是多组分的混合物，除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物(几百上千种)、培养基成份、无机盐等； 3、生化产物的稳定性低，易变质、易失活、易变性，对温度、pH 值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感； 4、对最终产品的质量要求高重要性：生物技术产品普通存在于一个复杂的多相体系中。
惟有经过分离和纯化等下游加工过程，才干制得符合使用要求的产品。
因此产品的分离纯化是生物技术工业化的必需手段。
在生物产品的开发研究中，分离过程的费用占全部研究费用的 50％以上；在产品的成本构成中，分离与纯化部份占总成本的 40~80％；精细、药用产品的比例更高达 70~90％。
显然开辟新的分离和纯化工艺是提高经济效益或者减少投资的重要途径。
5、为何生物技术领域中往往浮现“丰产不丰收”的现象？第二章预处理、过滤和细胞破碎1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速率；出去大部份可溶性杂质，并尽可能使产物转入便于以后处理的相中(多数是液相)，以便于固液分离及后提取工序的顺利进行。
：①加热法。
升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用于粘度随温度变化较大的流体。
控制适当温度和受热时间，能使蛋白质凝结形成较大颗粒，进一步改善发酵液的过滤特性。
包涵体的提取实验报告
一、实验目的1. 学习包涵体蛋白的提取方法。
2. 掌握包涵体蛋白的纯化技术。
3. 了解包涵体蛋白的分离和鉴定。
二、实验原理包涵体是细菌在表达外源蛋白时，由于蛋白折叠错误而形成的无活性蛋白聚集体。
本实验通过裂解细菌细胞，提取包涵体蛋白，然后对其进行纯化、分离和鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）BL21(DE3)pLysS大肠杆菌菌株，含有待表达的外源蛋白基因。
（2）裂解缓冲液：50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA。
（3）蛋白上样缓冲液：50 mM Tris pH 6.8，2% SDS，10% β-巯基乙醇，0.1% 亮蓝R250。
（4）SDS-PAGE凝胶制备试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、SDS、甘氨酸等。
（5）电泳设备：垂直电泳仪、电泳槽、电源等。
（6）层析设备：层析柱、层析板、紫外检测仪等。
2. 实验仪器：（1）超声波破碎仪（2）离心机（3）恒温水浴锅（4）移液器（5）微量移液器（6）紫外分光光度计（7）凝胶成像系统四、实验步骤1. 菌株培养与诱导表达（1）将BL21(DE3)pLysS大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）将过夜培养的菌液按1:100比例接种于LB液体培养基中，37℃培养至OD600约为0.6。
（3）加入IPTG诱导剂，使终浓度为0.5 mM，37℃培养4小时。
2. 包涵体蛋白的提取（1）将诱导表达的菌液在冰浴中冷却30分钟。
（2）将菌液以5000 rpm离心10分钟，收集菌体。
（3）将菌体用裂解缓冲液重悬，超声破碎45秒，重复两次。
（4）以10000 rpm离心30分钟，收集上清液。
3. 包涵体蛋白的纯化（1）将上清液加入等体积的蛋白上样缓冲液，煮沸5分钟。
（2）以10000 rpm离心5分钟，收集沉淀。
（3）将沉淀用蛋白上样缓冲液重悬，加入SDS-PAGE凝胶制备试剂，混匀。
4. 包涵体蛋白的分离与鉴定（1）制备SDS-PAGE凝胶，按照分子克隆上的配方，采用变性不连续凝胶电泳。
酶生产的下游工艺—细胞破碎
胞外产物 浓缩 初步分离 高度纯化
制剂 产品
复性
工作任务（一）细胞壁的结构及组成
工作任务（一）细胞壁的结构及组成
各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 物
壁厚 /nm
层次
主要 组成
革兰氏阳 性细菌
15 ~ 50
革兰氏阴性 放线
细菌
菌
10 ~ 13 同G+
酵母菌 100 ~ 300
霉菌 100 ~ 250
单层
肽聚糖 (40% ~
90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
多层
肽聚糖 (5% ~ 10%)
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%) 磷脂 蛋白质
多层
多层
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体。一般，卧
高
式比立式珠磨破碎效率高：因为立式机中向
速
上流动的液体在某种程度上会使研磨珠流态
珠
化，从而降低其研磨效率。
磨
研磨珠：玻璃(密度为2.5g／cm3)或氧化锆(密度
法
为6.0 g／cm3)微球(粒径约0.1～10mm)，填充
率为80％～85％。
工作任务（二）细胞壁的破碎
高 速 珠 磨 法
原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合， 珠子之间及珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞 壁破裂，释放内含物。
工作任务（二）细胞壁的破碎
细胞破碎方法
生产厂商:
瑞士WAB
公司
高
德国西门子
生物分离工程名词解释
生物分离工程：，从生物产品的生产技术来看：指生物产品的下游加工过程（Down stream processing）。
➢从生物工程的新技术看，主要指工程菌和动植物细胞产品的分离与纯化。
➢从研究对象看，主要指生物大分子产品的分离与纯化。
➢➢➢包涵体(inclusion body)：外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体。
➢初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。
➢胶体是一种尺寸在1～100 nm以至1000 nm的分散体。
它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。
➢沉淀定义：物理环境的变化引起溶质溶解度降低，生成固体凝聚物（aggregrates)的现象➢盐析：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。
➢利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法➢泡沫分离：根据表面吸附的原理，利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体对液相中的溶质和颗粒进行分离，又称泡沫吸附分离，泡沫分级或鼓泡分级。
➢在一种流体相间内或者两种流体相间，有一层薄的凝聚相物质，其把流体相分隔开来成为两部分，并在两部分之间进行传质作用，这一薄层物质称为膜。
➢膜分离技术➢利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。
➢微滤（ Microfiltration ，MF）：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力差为推动力，使不溶性物质得以分离的操作，孔径分布范围在0.025~14μm之间；➢超滤（ Ultrafiltration ，UF）：分离介质同上，但孔径更小，为0.001~0.02 μm，分离推动力仍为压力差，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质；➢反渗透（Reverse osmosis， RO）：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.0001~0.001 μm之间；（由于分离的溶剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）；➢纳滤（Nanofiltration，NF ）：以压力差为推动力，从溶液中分离300~1000小分子量的膜分离过程，孔径分布在平均2nm；➢电渗析(Electrodialysis，ED)：以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；➢超滤：根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间分子量的差别进行分离的方法。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤引言：包涵体蛋白纯化是生物技术和生物制药领域中重要的工艺步骤之一。
通过纯化包涵体蛋白，可以获得高纯度的目标蛋白，为后续的研究和应用提供了基础。
本文将介绍包涵体蛋白纯化的一般步骤，包括细胞破碎、包涵体回收、包涵体溶解、亲和层析和蛋白质再折叠等。
一、细胞破碎：细胞破碎是包涵体蛋白纯化的第一步。
通常使用机械方法（如超声波破碎或高压均质）或化学方法（如洗涤剂破碎）来破碎细胞，释放包涵体蛋白。
需要注意的是，破碎条件应该使得包涵体蛋白能够充分溶解而不会发生蛋白质降解。
二、包涵体回收：包涵体蛋白通常以包涵体的形式存在于细胞裂解液中。
包涵体回收是将包涵体从其他细胞成分中分离出来的过程。
一种常用的方法是通过离心将细胞碎片和其他细胞成分与包涵体分离。
此外，还可以使用过滤、沉淀或超滤等技术来实现包涵体的回收。
三、包涵体溶解：包涵体蛋白在还原条件下通常以不溶性的形式存在。
为了使包涵体蛋白能够溶解，通常需要添加变性剂（如尿素或胍氯酸）和还原剂（如二硫醇）。
通过调节溶解条件，可以使得包涵体蛋白迅速溶解为可溶性蛋白。
四、亲和层析：亲和层析是包涵体蛋白纯化的关键步骤之一。
通过将目标蛋白与亲和层析介质上的亲和配体结合，可以实现目标蛋白的富集和纯化。
亲和配体可以是金属离子、抗体或亲和标签等。
在亲和层析过程中，需要注意选择合适的亲和配体和适宜的洗脱条件，以实现对目标蛋白的高效纯化。
五、蛋白质再折叠：由于包涵体蛋白在还原条件下溶解，其折叠状态通常不完整。
为了使得目标蛋白具有正确的结构和功能，需要对其进行再折叠。
常用的再折叠方法包括逐渐降低变性剂浓度、添加折叠辅助剂和调节pH 值等。
通过适当的再折叠条件，可以使得目标蛋白恢复到天然的折叠状态。
结论：包涵体蛋白纯化是一项复杂的工艺步骤，需要经过细胞破碎、包涵体回收、包涵体溶解、亲和层析和蛋白质再折叠等步骤。
通过这些步骤的有序进行，可以得到高纯度和高活性的包涵体蛋白。
随着生物技术和生物制药的不断发展，对包涵体蛋白纯化技术的要求也越来越高，希望通过不断的研究和创新，能够进一步提高包涵体蛋白纯化的效率和纯度，为生物医药领域的研究和应用提供更好的支持。
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0),2mM EDTA,100mM NaCl,0.5%Triton X-100,1mg/ml溶菌酶。
(溶菌酶在这个pH围比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的."取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE.这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体?"而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。
包涵体的分离纯化
信息 体内，蛋白折叠错误，引发疾病。如：帕 金森、疯牛病等。 蛋白折叠理论也是蛋白质组学中的重要研 究领域。
复性常用方法 1.稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺 点是体积增加较大，后续处理困难。 稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体 （较低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL。 脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中， 使折叠中间体保持在较低的水平。例：在510mg/mL终浓度下，溶菌酶复性收率可达80%以 上。
包涵体的复性前准备
洗涤： 洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋 白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先 洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在 50mM Tris pH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗涤。此 外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片 和膜蛋白。
包涵体的溶解
复性过程中的添加剂
低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠， 但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折 叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。 可防止不可逆聚集体的出现。 盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非 变性浓度下是有效的促进剂。
5.分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构 酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠 酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程 的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。 体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入 分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基 因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。
2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降 低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不 适合大规模操作，无法应用到生产规模。 3. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许 变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使 用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况， 且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白 聚集于膜上）。
第三章 细胞的破碎与分离
细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强 度。
第三章 细胞的破碎与分离
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
概述
• 不同类型的细胞分泌目标产物的类型：
• 动物细胞多分泌到细胞外培养液 • 植物细胞多为胞内产物 • 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外， 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破 碎。
概述 • 大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些 多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵 液中。 • 有些目标产物存在于生物体中。
在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水 解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲 液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞 悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
超声波破碎的适用范围
超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物 的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对 酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物 质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实 验室小规模细胞破碎中常用。
化学破碎
酶促破碎
一 机械法
机械破碎法又可分为： 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding）
生物物质分离工程考试重点
题型：问答简答综合内容1.固液分离（沉降、离心、过滤、膜分离）比较，适用对象2.液-液传质分离（萃取、双水相、反胶束、超临界、泡沫分离）3.如何减少，避免失活问题双水相反胶束4.分离原理适用对象特点5.细胞破碎特点3.发酵液的预处理和菌体的回收（为什么进行预处理；预处理方法；过滤器的主要特点）3.2悬浮液的预处理（原因）原因：1.产品在培养液或菌体中浓度低2.产品与许多杂质混在一起3.非牛顿型流体目的：1.改变发酵液的物理性质，提高从悬浮液中分离固形物的速率，提高固液分离器的效率。
2.尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液相）。
3.去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。
方法：1.加热法：①降低粘度②提供能量，促进细胞聚集③破坏凝胶结构——利于细胞聚集2.调节pH：①细胞聚集与pH值有关②简便，降低粘度③如何保持pH局部值不过高/低3.凝聚：（无机类电解质或高分子物质）表面电荷的简单中和，消除双电层，产生氢键结合。
4.絮凝：使用絮凝剂（天然或者合成的大分子量聚电解质以及生物絮凝剂）将胶体粒子联网，絮凝剂起架桥作用。
5.使用惰性助滤剂：一种颗粒均匀质地坚硬不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围。
3.4过滤法（主要特点型号）定义：过滤是迫使液体通过固体支撑物或过滤介质，把固体截留，从而达到固液分离的目的。
常用新型过滤器：1.真空过滤器：转鼓（优点：用于大规模生物分离的主要过滤设备，可以分离较难过滤的悬浮固粒，劳动强度小；缺点：表面利用率低，洗涤效果差，滤饼卸料时易剥落；滤布更换困难，不便观察）水平带式（优点：处理量大，操作灵活，洗涤效果好；占地面积大；缺点：有效过滤面积小，投资较高）水平圆盘（大型化，洗涤效果好）水平回转翻盘（大型化，适用于过滤密度大，浓度高的粗颗粒悬浮液）2.压滤器（适用于固含量高难处理的细颗粒料液）：板框压滤器加压叶滤器气压罐式连续压滤器带式压滤器3.错流过滤：料液给过滤介质表面一个平行的大流量的冲刷，则过滤介质表面积累的滤饼就会减少到可以忽略的程度，而通过过滤介质的流速则比较小。
包涵体名词解释
包涵体名词解释
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。
简介
与一般微生物细胞相比,基因工程菌的细胞破碎要复杂得多。
基因工程菌新合成的重组蛋白,是没有活性的、折叠构型有误的蛋白质,叫包涵体。
细胞破碎后先分离出包涵体,将包涵体溶解在变性剂中。
再加入还原剂,还原蛋白质中的半胱氨酸,使二硫键断裂,得到单体肽链再复性重新折叠。
特性
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
病毒包涵体
包涵体有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体）。
有的包涵体还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Vegri）小体。
《蛋白质纯化与鉴定实验指南》
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二、Hela细胞核提取物的Sephacry S-300 HR柱层析98实验3 序列特异性DNA亲和层析101一、用制备凝胶电泳纯化寡核苷酸 105二、DNA亲和介质的制备107三、亲和层析中非特异性竞争DNA的正确使用112四、亲和层析的操作 113实验4 DNA酶I足迹分析117一、DNA酶I足迹探针的制备118二、DNA酶I足迹分析122实验5 凝胶迁移变动分析126实验6 肝素-Sepharose CL-2B的制备129试剂的配制 131参考文献 138第3单元 大肠杆菌中过表达重组蛋白的纯化 Richard R. Burgess和Mark W. Knuth141实验1 大肠杆菌细胞的破碎和包涵体的配制144实验2 包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析148 实验3 可溶性提取物（核心RNA聚合酶-复合物）的聚乙烯亚胺沉淀和免疫亲和层 152 析一、PEI沉淀法分级分离可溶性提取物153二、免疫亲和层析 154实验4 定量测定与制备小结158一、蛋白质的定量测定 158二、定量SDS凝胶染色与扫描159三、定量蛋白质斑点印迹 160四、酶测定法 163五、纯化记录表 164六、蛋白质纯化总结表与主要组分的总电泳照片 165实验5 蛋白质的鉴定167一、纯蛋白质的紫外光谱——A280mm/A260nm167二、消光系数的测定（Scopes法）167三、过载染色SDS凝胶扫描法估测纯度169四、由非变性凝胶电泳迁移率法评估均一性 169方案补充实验：从过表达细菌提纯 172一、快速蛋白质斑点印迹试验 172二、是可溶的还是不溶的？ 173三、溶解包涵体沉淀需多少N-十二烷基肌氨酸钠？ 173四、沉淀和RNA聚合酶需多少聚乙烯亚胺？174五、从PEI沉淀洗脱和RNA聚合酶需多少盐？175六、透析法除N-十二烷基肌氨酸钠需多少时间？ 176五、胰岛素受体对胰岛素亲和性的测定 202实验2 膜胰岛素受体的溶解205一、胰岛素受体的溶解及活性测定 211二、溶解膜蛋白用的去垢剂的筛选 213实验3 溶解受体的凝集素亲和层析215实验4 部分纯化受体的胰岛素亲和层析219一、胰岛素亲和层析 220二、配体与活化介质的偶联 221实验5 胰岛素受体与胰岛素的交联223实验6 胰岛素激素的胰岛素受体自磷酸化226实验7 胰岛素受体糖基化的分析229试剂的配制 234参考文献 240附录 243附录1 pH的测量243附录2 缓冲液的配制245附录3 电导率的测量247附录4 固态硫酸铵法分级分离248附录5 蛋白质的SDS-PAGE电泳249一、电泳 251二、凝胶染色 256三、样品制备（沉淀法） 259附录6 蛋白质的过甲酸氧化263附录7 用亚氨基二乙酸Sepharose 6B分离磷酸肽265附录8 蛋白质内序分析用肽段的分离与纯化267附录9 推荐读物269技术索引 271主题索引 273。
包涵体简介
4、复性
低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性 或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。
1、盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下 是有效的促进剂。 2、分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅 氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调 节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白 质的折叠复性。
4、复性
3、超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过而 截留蛋白质。
优缺点：在生产中较多使用，规模较大，易于对透析速度进行控制。但不适 合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆地变性。
4、色谱复性：是最近研究较多并成功地在生产中应用的一种 复性方法，常用于复性的层析方法有疏水层析(HIC)法、亲和 层析(AFC)法等 。 凝胶过滤复性：蛋白质仅在胶粒中传质和扩散外，与介质之 间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用， 并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白 质的复性有利。 吸附型层析复性：层析柱平衡后，可将变性蛋白上样并吸附 在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂 蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在洗脱过 程中完成复性。
5、溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。 在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100 g至1 mg溶菌酶，37℃ 保温10 min，或者室温作用30 min。
2、洗涤包涵体
常用洗涤试剂：中性去垢剂和还原剂。 在包涵体表面吸附着大量的不溶性蛋白，通过包涵体的洗涤 能够除去一些影响重组蛋白活性的杂蛋白。例如，大肠杆菌 外膜蛋白OmpT在8 mol/L的尿素中具有蛋白水解酶的活性，可 能在包涵体的溶解中降解重组蛋白（但过高浓度的尿素或盐 酸胍会使包涵体溶解）。
生物分离工程
单元操作及其适用范围。
1.固液分离：过滤（真菌，细菌，细胞碎片），离心（真菌、病毒、细胞）2.细胞破壁：机械法，酶法，化学法（胞内产品、酶、实验）3.产品分离纯化：蒸馏（乙醇和溶剂回收）萃取（抗生素、酶、精制油）、沉淀（酶），吸附（抗生素），膜技术（脱盐和除热原、蛋白质溶液脱盐），液相色谱（干扰素、血制品、蛋白质和多肽抗生素和多肽）4.水和溶剂的去除浓缩（抗生素，咖啡喝果汁），干燥（多数药物，a-淀粉酶和单细胞蛋白）。
哪些单元操作适用于生物小分子物质的提取？哪些单元操作生物大分子的提取？答：适用于生物小分子的单元操作有：液体萃取、非活性基吸附、低压亲和色谱逆同、高效液相色谱、蒸发、反渗透、超滤。
适用于大分子的单元操作有：过滤、离心、双水相萃取、沉淀，电渗析液相色谱、电泳、等电聚焦、干燥。
生物技术下游加工过程的发展动向：①基础理论研究：选择性分离剂、数学模型②应用研究：提高分离过程选择性、开发新介质、提高分离纯化技术③工程问题研究④改善环境相容性发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？答：因为发酵液中发酵产物浓度较低，含有许多杂质，悬浮颗粒，细胞的相对密度与培养液相似，液相粘度大，大多为非牛顿型液体，需要预处理。
此外，预处理可达到如下目的：⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。
促进从悬浮液中固形物的分离速度，提高固液分离的效率。
⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。
⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）处理方法：加热法；絮凝和凝聚；调节PH；杂蛋白的去除；高价无机离子的去除；助滤剂和反应剂。
凝聚和絮凝过程有何区别？答：凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm 大小块状凝聚体的过程。
机理：中和粒子表面电荷、消除双电层结构、破坏水化膜絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm 大小絮凝团的过程。
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由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其 强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
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11
细胞破碎
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12
细胞破碎
1.珠磨法（Bead mill）
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13
细胞破碎
高压匀浆器
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
3)导电率测定法
细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相， 使导电率上升。
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破碎率的测定
0.05%美蓝染可编色辑pp结t 果
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基因工程包涵体的纯化
基因工程菌培养液不同表达形式的前处理
胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。 胞内表达：
胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收 集上清→纯化
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包涵体表达形式的优点
➢ 在一定程度上保持表达产物的结构稳定; ➢ 能避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集; ➢ 简化外源基因表达产物的分离操作; ➢ 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白
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包涵体表达形式的缺点
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须 通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因 而具有生物活性）的目标蛋白。 体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。
形成原因：
表达量过高、过快
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外源蛋白在大肠杆菌中的积累
蛋白 人胰岛素 β -丙酰胺酶
γ-人体干扰素
凝乳酶原 牛生长激素 β -内酰胺酶 人胰岛素原
产物占菌体总蛋白/%
50% 20% 25%
>30%
5%~26%
外源蛋白的积累 形成包涵体 在细胞间区 形成包涵体 形成包涵体 形成包涵体 形成间区包涵体 形成包涵体
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包涵体的纯化方法
收集菌体细胞 细胞破碎
包涵体的洗涤
目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性
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33
包涵体获得 几种常见的工艺路线(一)
机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨）
离心提取包含体
加变性剂溶解
除变性剂复性
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包涵体获得 几种常见的工艺路线（二）
机械破碎
膜分离获得包涵体
3
细菌细胞壁结构
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4
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5
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back6
酵母细胞壁结构
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7
一、细胞壁的组成和结构
微生物 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 酵母菌
霉菌
壁厚/nm
20-80
10-13
100-300
100-250
层次
单层
多层
多层
多层
主要组 成
肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
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包涵体的分离和蛋白质复性
细胞的破碎与分离
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1
概述
➢很多生化产物存在于细胞内(胞内产物)
➢细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非 分泌型成分的基础。
胞内物
分离
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2
概述
药物名称
胰岛素
人生长激素 （HGH）
α--干扰素
宿主 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌
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用途 治疗糖尿病
治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血 病和卡波济肉瘤
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高可压 编辑p匀pt 浆器针型阀结构简图 14
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细胞破碎
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀
锥型阀 球型细胞破碎阀
高压匀浆器各种 可编辑阀 ppt 型设计
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细胞破碎
超声破碎法（Ultrasonication
在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象 （cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的 冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪 切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。
胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压 冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。
不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集 沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。
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包涵体的分离和蛋白质复性
包涵体：
指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性 的固体颗粒 。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
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物理破碎方法
➢渗透压冲击 ➢冻融法
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24
破碎率的测定
1. 破碎率的测定
1)直接测定法
采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。
2)目的产物测定法
将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的 产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得 的标准数值比较，计算其破碎率。
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正常人耳能听到的声音的频率范围
次声
超声
20Hz
20000Hz
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20
细胞破碎
撞击破碎
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化学破碎方法
➢酸碱法 ➢表面活性剂 ➢有机溶剂
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化学破碎方法
化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
加变性剂溶解包含体
除变性剂复性
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35
1）包涵体的洗涤
细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，
还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖 等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分 子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的 弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除 去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达 产物为原则。
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
葡聚糖
多聚糖
（30-40%） （80-90%）
甘露聚糖 脂类
（30%） 蛋白质
蛋白质
（6-8%）
脂类
（8.5-
13.5%）
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8
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9
细胞破碎机理图
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10
细胞破碎
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构 越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及 革兰氏阳性细菌的坚固；