细胞的破碎与分离包涵体

肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
葡聚糖
多聚糖
（30-40%） （80-90%）
甘露聚糖 脂类
（30%） 蛋白质
蛋白质
（6-8%）
脂类
（8.5-
13.5%）
可编辑ppt
8
可编辑ppt
9
细胞破碎机理图
可编辑ppt
10
细胞破碎
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构 越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及 革兰氏阳性细菌的坚固；
胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压 冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。
不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集 沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。
可编辑ppt
27
包涵体的分离和蛋白质复性
包涵体：
指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性 的固体颗粒 。
细胞的破碎与分离
可编辑ppt
1
概述
➢很多生化产物存在于细胞内(胞内产物)
➢细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非 分泌型成分的基础。
胞内物
分离
可编辑ppt
2
概述
药物名称
胰岛素
人生长激素 （HGH）
α--干扰素
宿主 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌
可编辑ppt
用途 治疗糖尿病
治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血 病和卡波济肉瘤
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程 度和它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其 强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
可编辑ppt
11
细胞破碎
可编辑ppt
12
细胞破碎
1.珠磨法（Bead mill）
可编辑ppt
13
细胞破碎
高压匀浆器
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
加变性剂溶解包含体
除变性剂复性
可编辑ppt
35
1）包涵体的洗涤
细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，
还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖 等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分 子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的 弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除 去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达 产物为原则。
3)导电率测定法
细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相， 使导电率上升。
可编辑ppt
25
破碎率的测定
0.05%美蓝染可编色辑pp结t 果
26
基因工程包涵体的纯化
基因工程菌培养液不同表达形式的前处理
胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。 胞内表达：
胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收 集上清→纯化
3
细菌细胞壁结构
可编辑ppt
4
可编辑ppt
5
可编辑ppt
back6
酵母细胞壁结构
可编辑ppt
7
一、细胞壁的组成和结构
Biblioteka Baidu
微生物 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 酵母菌
霉菌
壁厚/nm
20-80
10-13
100-300
100-250
层次
单层
多层
多层
多层
主要组 成
肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
可编辑ppt
30
包涵体表达形式的优点
➢ 在一定程度上保持表达产物的结构稳定; ➢ 能避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集; ➢ 简化外源基因表达产物的分离操作; ➢ 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白
可编辑ppt
31
包涵体表达形式的缺点
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须 通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因 而具有生物活性）的目标蛋白。 体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
可编辑ppt
23
物理破碎方法
➢渗透压冲击 ➢冻融法
可编辑ppt
24
破碎率的测定
1. 破碎率的测定
1)直接测定法
采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。
2)目的产物测定法
将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的 产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得 的标准数值比较，计算其破碎率。
形成原因：
表达量过高、过快
可编辑ppt
28
可编辑ppt
29
外源蛋白在大肠杆菌中的积累
蛋白 人胰岛素 β -丙酰胺酶
γ-人体干扰素
凝乳酶原 牛生长激素 β -内酰胺酶 人胰岛素原
产物占菌体总蛋白/%
50% 20% 25%
>30%
5%~26%
外源蛋白的积累 形成包涵体 在细胞间区 形成包涵体 形成包涵体 形成包涵体 形成间区包涵体 形成包涵体
可编辑ppt
18
正常人耳能听到的声音的频率范围
次声
超声
20Hz
20000Hz
可编辑ppt
19
可编辑ppt
20
细胞破碎
撞击破碎
可编辑ppt
21
化学破碎方法
➢酸碱法 ➢表面活性剂 ➢有机溶剂
可编辑ppt
22
化学破碎方法
化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高可压 编辑p匀pt 浆器针型阀结构简图 14
可编辑ppt
15
细胞破碎
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀
锥型阀 球型细胞破碎阀
高压匀浆器各种 可编辑阀 ppt 型设计
16
可编辑ppt
17
细胞破碎
超声破碎法（Ultrasonication
在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象 （cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的 冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪 切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。
可编辑ppt
36
包涵体的分离和蛋白质复性
可编辑ppt
32
包涵体的纯化方法
收集菌体细胞 细胞破碎
包涵体的洗涤
目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性
可编辑ppt
33
包涵体获得 几种常见的工艺路线(一)
机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨）
离心提取包含体
加变性剂溶解
除变性剂复性
可编辑ppt
34
包涵体获得 几种常见的工艺路线（二）
机械破碎
膜分离获得包涵体