产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 —20120915

产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种
摘要:紫外线辐射是目前最为广泛的物理诱变因子之一，其引起菌体DNA结构变化的形式很多，如DNA链的
断裂、碱基的破坏等，但最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正
常配对，从而引起微生物突变或死亡。

以上次得到的高产的芽孢杆菌为出发菌株，利用紫外诱变的方法，
对得到的菌株进行诱变，以获取可高效发酵高产蛋白酶的突变株。

关键词：中性蛋白酶；芽孢细菌；紫外诱变
Production neutral protease spore bacterial mutation breeding
Abstract: the uv radiation is currently the most widely physical mutation factor, its cause bacteria in the form of DNA structure change a lot, such as DNA chain rupture, base damage and so on, but the main function is to make with chain of DNA is formed between adjacent pyrimidine thymine dimer, hinder the normal pairing between base, thus cause microbial mutation or death. Above time get high yield of bacillus for starting strain, the use of ultraviolet mutagenic method, gets the strain on mutation, in order to get high yield and high efficiency fermentation protease mutant strain. Keywords: neutral protease, Spore bacterium; Ultraviolet mutagenic
1 目的意义：
蛋白酶是重要的水解酶类，也是目前工业化运用最成功，产量最大的一类酶，占酶制剂市场的65％以上[1],其种类繁多，广泛存在动物内脏、植物茎叶果实以及环境微生物中[2],近年来，蛋白酶在水产品显现其作用，并广泛应用于各个领域。

然而，国内蛋白酶的生产及制备工艺还处在一个较低的水平.国内市场基本为外国酶制剂公司所垄断, 因此进行该酶的相关生产技术研究就能缓解这一局面。

通过对豆豉中的产蛋白酶菌株筛选，获得高产的菌株，并对其进行紫外处理，以期获得一株高产菌株，发展中国的酶产业。

[7]
2 材料方法：
2.1 材料
2.1.1 实验材料：筛得的高产菌株
2.1.2 实验试剂：
6mol/LNaOH ，1mol/LHCl ，无菌生理盐水
牛奶筛选固体培养基：脱脂牛奶：5.0g，酵母膏：3.0 g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000ml pH: 7.0
LB活化培养基：蛋白胨：10.0g；酵母膏： 5.0 g；氯化钠：10.0g；
蒸馏水：1000ml pH到 7.0
2.1.3 实验仪器：恒温水浴锅、培养皿70个、试管40、三角瓶9个、1000ul移液器、离心管、
离心机、大枪头一盒、接种环、涂布棒、恒温培养箱、高压灭菌锅、玻璃棒、精密pH 试纸、酒精灯、电磁炉、微波炉等
2.2 方法
2.2.1 材料准备：先制作好牛奶筛选固体培养基七瓶，每瓶200mL；一瓶无菌水45mL；十四
支无菌水，每支9mL；LB活化培养基一瓶；每瓶200mL；LB斜面25支，每支5mL；包好的平板，枪头等放入高压灭菌锅进行灭菌，121℃ 20分钟
2.2.2 产蛋白酶细菌的活化: 无菌条件下，用接种环挑取少量单菌落菌株接种到灭菌的活化
培养基，37℃ 180r/min 培养16-20小时
2.2.3 离心取活化好的菌液，取10mL加入到离心管，8000r/min 离心5min，再弃掉上清
夜，加入生理盐水，再离心一次，弃掉上清液，用生理盐水配成菌液。

2.2.4 紫外诱变以每个离心管为一个单位，取2mL配好的菌液加入培养皿，每个离心管取
四次。

并对这四个样做空白、1min、2min、3min紫外线处理。

2.2.5 梯度稀释对处理好的菌液，每个样从10-1～ 10-7依次稀释。

2.2.6 涂平板用上面的10-4～ 10-7菌液涂平板，每个浓度涂2个平行，包装37℃恒温倒置
培养24h。

2.2.7 经培养后，点数菌落数并测水解圈和菌落直径后，接种到斜面，每个单菌落5支管，
培养长满菌苔后于4℃冰箱中保存。

3 数据结果
3.1 致死率
3.2 菌落与水解圈直径测量
通过酪蛋白平板试验,根据菌落大小跟水解蛋白透明圈大小比值从样品中初步分离得到3株产蛋白酶的细菌。

并发现10-5度为计数适宜浓度。

结果如下表
菌种菌落直径（D/mm）水解圈直径（H/mm）比值(H/D)
1min10-5 9.0 3.0 3
8.0 3.0 2.667
2min10-4 8.5 3.5 2.429 10-6 9.5 4.0 2.375
3min10-7 10 3 3.33
10 3 3.33
对照10-5 6.0 1.5 4
4 讨论分析
4.1 致死率存在负项
在做的每一组数据中，都存在较稀浓度的菌落数多于较浓浓度的菌落数。

原因应该有两点：在吸取菌液时未进行摇匀，造成浓度分布不均，涂布时就有的菌多有的菌少；另一方面，涂布不规范，造成涂布不均匀，影响了计数。

4.2 未得到更高产的诱变菌株
原菌种H/D比值最高，未得到理想的诱变菌株。

可能原因:一，确实没有正向突变；二，突变菌株生长缓慢，菌落太小，没法进行测量。

4.3怎么选取最好的菌株
一般根据H/D比值，然而，存在菌落非常小，而透明圈非常大的情况，这时，也应该对其进行接种，保藏，可以利用基因工程，获得其基因，进行转基因育种。

4.4 接种时间的选取
这次实验接种的较早，有的菌落还太小，不适合测量。

最好再培养6个小时。

然而时间为傍晚，不能过夜，否则，菌落由于太密长成一片，更我无法测量和接种。

然而这样可能造成某些较好的菌漏选，所以，最好能再培养几个小时。

5 参考文献
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11（27）：1789-1799.
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[4] 宋园亮等，元阳豆豉中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究，中国微生态学杂
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