凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量

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图3 -1 凝胶层析分离原理示意图
【基本概念】
外水体积、内水体积、柱床体积 、洗脱体积
外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积 内水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是（Vt）凝胶柱所能容纳的总体积。
【基本概念】
洗脱体积（Ve）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱
液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现
柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积Vt 。
3）向柱内加入约1/4柱体积的洗脱液，将浓浆状 的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉 降约2～3㎝高度后打开出水口，待胶面上升到柱 记号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片 刻，等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱 液的储液瓶连接，调流速3～6mL/10min，用 2～3 倍柱床体积的洗脱液平衡。
以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。
Vo 和Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的Ve 就可 以得到这个组分的分配系数。在一定的条件下，Vt和Vo都是
恒定值。
大分子先从柱中流出→Ve值小→Kav值小 小分子后从柱中流出→Ve值大→Kav值大
对于完全排阻的大分子 Ve ＝ Vo 故 Kav ＝ 0
三、Vo 的测定
打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝
胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1 mL 蓝色葡聚糖-2000液，小心地绕柱壁一圈（距胶面 2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集），待溶 液完全渗入柱床后，关闭出水口，取1mL洗脱液沿 管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再 加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接， 打开出水口，开始洗脱。收集蓝色葡聚糖-2000洗
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
对于完全渗透的小分子 Ve ＝ Vt 故 Kav ＝ 1
Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋
白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各
个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系：
Kav ＝ －blgMr+c
由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有： Ve ＝ －b’lgMr+c’
一、凝胶的选择和处理
量取110mL Sephadex G-75于250 mL烧杯中，加入 洗脱液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷却至室温后抽真 空脱去颗粒空隙中的空气。
二、装柱
1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
2）凝胶柱床总体积（Vt）的测定：在距柱上端约5
㎝处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水 口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收
1)可用下式计算： Vt＝π×（D/2）2×h
2）根据 Vt＝Vo＋Vi 可以得到
3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水 的体积。
分配系数 表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度 分配关系。
Kav ＝
Ve － Vo
Vt －Vo
Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）
脱峰，测出洗脱体积Ve ，得出Vo值。
四、标准曲线的制作
1）用洗脱液配制标准蛋白质溶液（牛血清蛋白、鸡卵清蛋 白、溶菌酶）。
2）按上述方法加入1mL标准蛋白质混合液，以3mL/10min 的速度洗脱并收集洗脱液体积。
3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度0.2A），测
量它们的洗脱体积Ve。代入公式计算出各标准蛋白质的 Kav值。
例如Sephadex G-75
吸水率 7.5±ml/g
床体积指1g干的凝胶吸收水后的最终体积
例如Sephadex G-75 床体积 12～15 ml/g
干胶用量(g) = 柱(ml)床体积/凝胶床体积(ml/g)
【应用】
生物大分子的纯化 分子量测定 脱盐及去除小分子杂质 去热源物质 溶液的浓缩
【操作方法】
实验三 凝胶过滤层析法 测定蛋白质分子量
【目的要求】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 的实验技能
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离 物质的分子大小不同来进行分离的技术。
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。
Ⅲ 完全渗透的小分子
洗脱体积的测定
外水体积（Vo）：可以通过测定完全排阻的大分子物
质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测
定外水体积的物质。
内水体积（Vi）：可以通过测定完全渗透的小分子溶
质（如重铬酸钾）的洗脱体积来测定
即 Ve＝Vo＋Vi
推出 Vi＝ Ve －Vo
柱床体积（Vt）：
4）以Kav值为横坐标，标准蛋白质lgMr为纵坐标，绘出标
准曲线。
五、未知样品蛋白质分子量的测定
将待测待测鸡卵粘蛋白样品配制成5mg/mL溶液, 以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫
通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同
一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然 后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过
标准曲线即可求出其分子质量。
吸水率和床体积
吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包 括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。 Sephadex G-25～200 数字是吸水率×10
时所流出的体积。 Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。
对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其
洗脱体积
VBaidu Nhomakorabea ＝ Vo
对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体
积内，故其洗脱体积
Ve ＝ Vt
分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者
之间。
图3 -3 凝胶层析柱洗脱曲线示意图
Ⅰ 完全排阻的大分子 Ⅱ 中等分子