连云港海域养殖条斑紫菜丝状体黄斑病病原体的分离及鉴定
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
L-谷氨酸
HYWX-1
HYWX-2
柠檬交替假单胞 菌P.citrea
游海假交替 单胞菌 P.haloplankt is
麦氏假交替单胞 菌
P.macleodri
红色假交 替单胞菌 P. rubra
橙色假交替单胞菌 P.aurantia
-
-
nd
+
-
+
-
d
d
+
-
-
+
+
+
+
-
-百度文库
-
-
+
+
+
+
d
+
+
-
+
+
+
-
+
08年夏天连云港海域紫菜养殖场在丝 状体培育期大面积出现黄斑病，大量紫 菜最后烂死，导致严重经济损失。
条斑紫菜(Porphyrayezoensis) 是
我国主要紫菜栽培种，每年创造几十亿 美元的产值，随着条斑紫菜栽培规模的 不断扩大在其栽培过程中经常会遇到病 害、发育调节等各种问题，其病害问题 表现得越来越突出。多年来的大量研究 表明，紫菜的病烂由多方面原因引起的， 致病原因也非常复杂，其中微生物因素 是不可忽视的重要原因之一。
十倍稀释法：取8个1.5ml EP管，分别标记 1-8，吸取90ul无菌生理盐水于1.5ml的EP管 （1-8号），向1号管加入10ul菌液，混匀， 从1号管取10ul至2号管，混匀，依次至8号， 以上操作均无菌条件下进行。
取3个平皿分别标记为10-4，10-5，10-6，将原 先配制好的固体2216E培养基，加热溶解，趁 热，倒平板，冷却凝固后从4，5，6号EP管 中分别取100ul菌液对应加入平皿中，涂布， 倒扣于28℃生化培养箱中培养12小时。
HYWX-1生长曲线图
HYWX-2生长曲线图
两株菌的延滞期均为1h左右，菌株 HYWX-1约在16小时左右进入稳定期， 稳定期时间较长，菌株HYWX-2约在培 养16h后进入稳定期。
5、菌株的生理生化特征
按照微生物实验方法，进行各种生理 生化反应。
HYWX-1能水解明胶，氧化酶阳性，接 触酶阳性，ONPG反应阳性，H2S试验阳性， 葡萄糖氧化发酵(O/F）试验为氧化型， VP试验阴性，不能产生吲哚，能利用甘 油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，不利用 乳糖、果糖、纤维二糖、麦芽糖。
取HYWX-2号菌株经过 回复感染实验，发现其 能使健康紫菜贝壳样本 感染，
于第15天显示出黄色斑， 对照组无病害出现。结果 如图：
3、菌株形态 在光学显微镜下
观察菌体形态，进行 革兰氏染色，并用测 微尺测量菌体大小。
HYWX-1革兰氏染色
HYWX-2革兰氏染色
菌体大小为 HYWX-1： 1.7-2μm×0.8-1.2μm；
2216E培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g， 陈海水1000ml，5M氢氧化钠溶液调pH值 7.6～7.8。固体培养基另加2%的琼脂粉。
实验方法与结果
1、病原菌分离
菌株富集
菌液稀释
平板涂布
将一定量的陈置海水煮沸进行消毒，静止冷却 后，对样本贝壳进行冲洗，洗刷干净。于无菌 超净工作台内用菌铲将有黄斑病害的贝壳深层 处刮取一定粉末，加入2216E培养基中过夜培 养。
2、人工回复感染
将分离出来的菌株分别命名为HYWX-1、 HYWX-2。取2号菌在2216E液体培养基过夜培养， 血球计数板测定菌体浓度为7.665×108个/ml。 挑选健康的紫菜贝壳样本放入俩个玻璃缸中培 养（海水500ml），标记为2号，每天向其中加 入12ml菌液（2×108个/ml）,同时以不加有菌 体的空白样本为对照，观察感染现象。
研究内容及意义
病原菌的分离纯化
分子生物学 鉴定到种
形态、 生长特性研究
生理生化 鉴定到属
以往人们多从紫菜本身寻找解决途径， 忽略了在此过程中微生物的重要作用。
找出黄斑病的病原体并对其进行一定研 究，从而对该病进行防治，减少经济的 损失。
实验材料
1、样品 紫菜贝壳样本取自于连云港海域紫菜养
殖场（由李信书博士惠赠），海水取自 于连云港连岛海域。 2、培养基
HYWX-2： 2.2-2.7μm×0.7-1.3μm。
HYWX-2
俩株菌均革兰氏 染色均为阴性， 杆状菌，两株菌 的平板菌落形态 均为圆形、湿润、 边缘光滑、中间 突起，其中 HYWX-1呈现透明 状，HYWX-2呈乳 白色。
HYWX-1
4、菌株生长曲线的绘制
将菌株活化后分别以5%的接种量接种 到2216E液体培养基，在各菌的最适生长 条件下培养，从0h起，在1h取样,之后每 隔2h取出于OD600下测定菌液浓度,至24h 后每4h取样一次，持续40小时，以未接 种菌株的培养基做空白。根据数据结果 绘制生长曲线。
特
HYWX-2能水解明
征/ 菌
胶，氧化酶为阳性，
株 号
氧化 酶
VP
吲 哚
甲基 明胶 红 试验
硫化 葡萄糖
氢
发酵
接触酶阳性，ONPG HY
WX ＋
阳性，H2S试验阴性，-1
－－＋
＋
能发酵葡萄糖，甲 HY
基红，VP阴性，能
WX ＋ -2
－＋＋
＋
＋
＋
－
＋
产生吲哚；能利用
乳糖、纤维二糖、 甘油、丙氨酸、谷 氨酸、丙酮酸，而
通过Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology分析比较，初步鉴定该俩个 菌株属于Pseudoalteromonas sp.。
特 征/ 菌 株 号
苯丙 氨酸 脱羧 酶
ON PG
不能利用麦芽糖。 HY
WX ＋
＋
-1
HY
WX ＋
＋
-2
特征 需要有机生长因子 色素 4℃ 35℃ 9% NaCl 乳糖 D-果糖 D-半乳糖 D-纤维二糖 麦芽糖 甘油 蔗糖 酒石酸盐 尿素酶 DL-α-丙氨酸 甘露醇 山梨醇 氧化酶 酚红葡萄糖肉汤
-
+
-
+
-
-
+
-
-
-
+
+
d
+
-
+
＋
+
-
d
+
-
-
-
+
d
d
-
-
d
-
-
-
+
+
-
d
+
+
-
-
+
-
-
+
+
-
+
+
-
-
-
-
-
d
+
-
d
-
+
nd
+
+
-
+
+
+
+
d
+
nd
+
-
-
-
-
d
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
nd
+
+
+
+
d
nd
+
上表是HYWX-1、HYWX-2与已知的交替 假单胞菌（查阅于其它文献资料）之间 的生理生化性质的比较，
研究课题： 连云港海域养殖条斑紫菜丝状
体黄斑病病原体的分离及鉴定
导师：王洪斌 副教授 生工052 夏亚明
答辩提纲：
研究背景知识 研究内容及意义 实验材料 实验方法与结果 结论 问题与展望
研究背景知识
紫菜养殖阶段
丝状体培育 于贝壳内进行 形成壳孢子
黄泥 斑红 病病
叶状体养殖
赤壶 腐状 病病
HYWX-1
HYWX-2
柠檬交替假单胞 菌P.citrea
游海假交替 单胞菌 P.haloplankt is
麦氏假交替单胞 菌
P.macleodri
红色假交 替单胞菌 P. rubra
橙色假交替单胞菌 P.aurantia
-
-
nd
+
-
+
-
d
d
+
-
-
+
+
+
+
-
-百度文库
-
-
+
+
+
+
d
+
+
-
+
+
+
-
+
08年夏天连云港海域紫菜养殖场在丝 状体培育期大面积出现黄斑病，大量紫 菜最后烂死，导致严重经济损失。
条斑紫菜(Porphyrayezoensis) 是
我国主要紫菜栽培种，每年创造几十亿 美元的产值，随着条斑紫菜栽培规模的 不断扩大在其栽培过程中经常会遇到病 害、发育调节等各种问题，其病害问题 表现得越来越突出。多年来的大量研究 表明，紫菜的病烂由多方面原因引起的， 致病原因也非常复杂，其中微生物因素 是不可忽视的重要原因之一。
十倍稀释法：取8个1.5ml EP管，分别标记 1-8，吸取90ul无菌生理盐水于1.5ml的EP管 （1-8号），向1号管加入10ul菌液，混匀， 从1号管取10ul至2号管，混匀，依次至8号， 以上操作均无菌条件下进行。
取3个平皿分别标记为10-4，10-5，10-6，将原 先配制好的固体2216E培养基，加热溶解，趁 热，倒平板，冷却凝固后从4，5，6号EP管 中分别取100ul菌液对应加入平皿中，涂布， 倒扣于28℃生化培养箱中培养12小时。
HYWX-1生长曲线图
HYWX-2生长曲线图
两株菌的延滞期均为1h左右，菌株 HYWX-1约在16小时左右进入稳定期， 稳定期时间较长，菌株HYWX-2约在培 养16h后进入稳定期。
5、菌株的生理生化特征
按照微生物实验方法，进行各种生理 生化反应。
HYWX-1能水解明胶，氧化酶阳性，接 触酶阳性，ONPG反应阳性，H2S试验阳性， 葡萄糖氧化发酵(O/F）试验为氧化型， VP试验阴性，不能产生吲哚，能利用甘 油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，不利用 乳糖、果糖、纤维二糖、麦芽糖。
取HYWX-2号菌株经过 回复感染实验，发现其 能使健康紫菜贝壳样本 感染，
于第15天显示出黄色斑， 对照组无病害出现。结果 如图：
3、菌株形态 在光学显微镜下
观察菌体形态，进行 革兰氏染色，并用测 微尺测量菌体大小。
HYWX-1革兰氏染色
HYWX-2革兰氏染色
菌体大小为 HYWX-1： 1.7-2μm×0.8-1.2μm；
2216E培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g， 陈海水1000ml，5M氢氧化钠溶液调pH值 7.6～7.8。固体培养基另加2%的琼脂粉。
实验方法与结果
1、病原菌分离
菌株富集
菌液稀释
平板涂布
将一定量的陈置海水煮沸进行消毒，静止冷却 后，对样本贝壳进行冲洗，洗刷干净。于无菌 超净工作台内用菌铲将有黄斑病害的贝壳深层 处刮取一定粉末，加入2216E培养基中过夜培 养。
2、人工回复感染
将分离出来的菌株分别命名为HYWX-1、 HYWX-2。取2号菌在2216E液体培养基过夜培养， 血球计数板测定菌体浓度为7.665×108个/ml。 挑选健康的紫菜贝壳样本放入俩个玻璃缸中培 养（海水500ml），标记为2号，每天向其中加 入12ml菌液（2×108个/ml）,同时以不加有菌 体的空白样本为对照，观察感染现象。
研究内容及意义
病原菌的分离纯化
分子生物学 鉴定到种
形态、 生长特性研究
生理生化 鉴定到属
以往人们多从紫菜本身寻找解决途径， 忽略了在此过程中微生物的重要作用。
找出黄斑病的病原体并对其进行一定研 究，从而对该病进行防治，减少经济的 损失。
实验材料
1、样品 紫菜贝壳样本取自于连云港海域紫菜养
殖场（由李信书博士惠赠），海水取自 于连云港连岛海域。 2、培养基
HYWX-2： 2.2-2.7μm×0.7-1.3μm。
HYWX-2
俩株菌均革兰氏 染色均为阴性， 杆状菌，两株菌 的平板菌落形态 均为圆形、湿润、 边缘光滑、中间 突起，其中 HYWX-1呈现透明 状，HYWX-2呈乳 白色。
HYWX-1
4、菌株生长曲线的绘制
将菌株活化后分别以5%的接种量接种 到2216E液体培养基，在各菌的最适生长 条件下培养，从0h起，在1h取样,之后每 隔2h取出于OD600下测定菌液浓度,至24h 后每4h取样一次，持续40小时，以未接 种菌株的培养基做空白。根据数据结果 绘制生长曲线。
特
HYWX-2能水解明
征/ 菌
胶，氧化酶为阳性，
株 号
氧化 酶
VP
吲 哚
甲基 明胶 红 试验
硫化 葡萄糖
氢
发酵
接触酶阳性，ONPG HY
WX ＋
阳性，H2S试验阴性，-1
－－＋
＋
能发酵葡萄糖，甲 HY
基红，VP阴性，能
WX ＋ -2
－＋＋
＋
＋
＋
－
＋
产生吲哚；能利用
乳糖、纤维二糖、 甘油、丙氨酸、谷 氨酸、丙酮酸，而
通过Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology分析比较，初步鉴定该俩个 菌株属于Pseudoalteromonas sp.。
特 征/ 菌 株 号
苯丙 氨酸 脱羧 酶
ON PG
不能利用麦芽糖。 HY
WX ＋
＋
-1
HY
WX ＋
＋
-2
特征 需要有机生长因子 色素 4℃ 35℃ 9% NaCl 乳糖 D-果糖 D-半乳糖 D-纤维二糖 麦芽糖 甘油 蔗糖 酒石酸盐 尿素酶 DL-α-丙氨酸 甘露醇 山梨醇 氧化酶 酚红葡萄糖肉汤
-
+
-
+
-
-
+
-
-
-
+
+
d
+
-
+
＋
+
-
d
+
-
-
-
+
d
d
-
-
d
-
-
-
+
+
-
d
+
+
-
-
+
-
-
+
+
-
+
+
-
-
-
-
-
d
+
-
d
-
+
nd
+
+
-
+
+
+
+
d
+
nd
+
-
-
-
-
d
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
nd
+
+
+
+
d
nd
+
上表是HYWX-1、HYWX-2与已知的交替 假单胞菌（查阅于其它文献资料）之间 的生理生化性质的比较，
研究课题： 连云港海域养殖条斑紫菜丝状
体黄斑病病原体的分离及鉴定
导师：王洪斌 副教授 生工052 夏亚明
答辩提纲：
研究背景知识 研究内容及意义 实验材料 实验方法与结果 结论 问题与展望
研究背景知识
紫菜养殖阶段
丝状体培育 于贝壳内进行 形成壳孢子
黄泥 斑红 病病
叶状体养殖
赤壶 腐状 病病