实验10 细胞中酶的定位

实验9 细胞内酶的定位

酶是生物催化剂，它催化体内各种生物化学反应，其本质是蛋白质。酶具有高度特异性，酶细胞化学就是利用酶催化的生物化学反应的中间产物或终产物，使某些试剂产生颜色变化，从而间接显示酶的位置和活性强弱。酶的显示方法很多，根据反应原理，主要包括金属盐沉淀法、偶氮偶联法、吲哚酚法、四唑盐法和底物标记法等。对照方法在酶细胞化学中非常重要，许多酶在保存时被破坏而得出假阴性或因其他酶的作用或操作问题得出假阳性。因此在做标本片时，应同时制作对照片。阳性对照片可证明试剂已起作用，阴性对照片通常的方法是：用沸水或一种化学药品破坏标本片上的酶，或将阴性对照片放入无基质的反应混合液，其余处理过程相同。

酸性磷酸酶(ACP)是溶酶体的特征性酶，定位于溶酶体内。通常酸性磷酸酶在pH=5左右时发生作用，能水解磷酸酯而释放出磷酸基，PO43-与底物中硝酸铅反应生成磷酸铅沉淀物。由于这些沉淀物是无色的，在与黄色的硫化铵反应，生成棕黄色到棕黑色的硫化铅沉淀而被显示出来。

碱性条件下(pH9.2～9.8)，碱性磷酸酶经镁离子激活后可以分解磷酸酯，释放出磷酸根离子，磷酸根与钙盐反应，生成磷酸钙沉淀物。因磷酸钙无色，需与硝酸钴反应生成磷酸钴，再和黄色硫化铵作用形成黑色的硫化钴沉淀物，从而能够显示出细胞内碱性磷酸酶的分布。

【实验目的】

了解碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的细胞化学染色技术及其在细胞中的分布。

【实验器材、材料和药品】

1．器材

显微镜、剪刀、镊子、解剖针、染色缸、载玻片、盖玻片、吸水纸、恒温水浴箱、注射器

2．材料

小鼠

3．试剂及其配制

（1）3%淀粉溶液

（2）0.05mol/L乙酸缓冲液

A液(0.2mol/L乙酸液)：冰醋酸1．2ml加蒸馏水至100ml。

B液(0.2mol/L乙酸钠液)：NaAc·3H2O 2.72g加蒸馏水至lOOml。

取A液30ml+B液70ml+蒸馏水300ml即成0.05mol/L乙酸缓冲液，置4℃保存。（3）甲醛钙固定液

甲醛lOml，10%CaCl2 lOml，蒸馏水80ml。

（4）2％硫化铵液(临用时配)

硫化铵2ml+蒸馏水98ml。

（5）酸性磷酸酶作用液

称取硝酸铅25mg，加入0.05mol/L乙酸缓冲液22.5ml，搅动使之全部溶解后，再缓慢的逐滴加入3%β-甘油磷酸钠液2.5ml，边加边搅动，防止产生絮状沉淀；对照组的作用液不加β-甘油磷酸钠液，以蒸馏水代替。

（6）碱性磷酸酶作用液

3%β-甘油磷酸钠10ml，2%巴比妥钠10ml，2%CaCl22ml，2%MgCl21ml，蒸馏水20ml。（7）2%硝酸钴

【实验方法和步骤】

1.酸性磷酸酶的定位

前处理：实验前4～6d用无菌注射器取已经灭菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔内，每天1次，以激活吞噬细胞；颈椎脱臼法（右手抓住鼠尾，用力向后拉，左手拇指与食指同时按住鼠头，使脊髓和脑髓间断）处死小鼠（图？），剖开腹腔，吸取腹腔液。

图颈椎脱臼法处死小鼠（刘东江等，2005）

制片：将腹腔液滴一滴于冰冻的干净载玻片上，并用牙签涂开，自然干燥；标本放入作用液中，37℃保温30min；蒸馏水中漂洗片刻；放入甲醛钙固定液固定5min；蒸馏水中漂洗；放入2％硫化铵液3～5min；蒸馏水中漂洗。

镜检：显微镜下观察，小鼠腹腔巨噬细胞为不规则形状，阳性细胞内有大小不等的棕色或棕黑色的颗粒就是酸性磷酸酶；对照组细胞内无棕色或棕黑色的颗粒。

2．碱性磷酸酶的定位

制片：将新鲜小鼠肾组织冰冻切片置于37℃碱性磷酸酶作用液和对照作用液中孵育30～60min；蒸馏水漂洗数次；浸入2%硝酸钴溶液3～5min；蒸馏水漂洗1min；2％硫化铵液处理1min；蒸馏水漂洗数次；晾干，甘油明胶封片。

镜检：显微镜下，阳性细胞中碱性磷酸酶活性部位呈黑色，细胞核呈红色；对照组细胞无黑色部位。

【作业与思考题】

1．绘图表示碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的分布。

2．细胞内碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的分布有何差别？