第3章免疫原和抗血清的制备

IgG 胃蛋白酶
F(ab\)2+Fc\
F(ab\)2作为抗体试剂用于实验。
2.氧化法和还原法：
能将Ig轻重链分开，多用还原法。
（二）可溶性抗原的纯化
要制备特异性高的抗血清，通常要纯化抗原， 一般可采用以下方法：
1、超速离心法（常用于分离亚细胞成分） ●差速离心法－低速和高速离心交替进行 ●密度梯度离心法－区带离心法 原理：利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使 具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层 内，达到分离的目的。 适用于大分子抗原的分离，如：IgM、C1q等。 也用于较轻的抗原物质，如：载脂蛋白A
5、亲和层析法：
原理：利用生物大分子之间具有的专一性 亲和力而设计的层析技术。如：抗原和抗 体、激素和受体、IgG和SPA
优点是：纯度高、简单快捷。 缺点： 成本贵。
(1)亲和层析支持物的选择
• 应符合以下条件：
①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合
原理：超声波的机械振动而破坏 适用于: 微生物和组织细胞 优点是: 操作简单、重复性好、
节省时间。
4、表面活性剂处理:
常用的表面活性剂有: 十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型） 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）
聚山梨酯 （非离子型) 、新洁尔灭等 原理：一定温度、PH、低离子强度条件 下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，
三、动物采血法
颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡 静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊
第四节 抗血清的鉴定和保存
一、抗血清的鉴定
抗血清的分离：室温自然凝固——37度温箱1小 时——4度冰箱过夜——血块收缩后分离。
抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法 抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA 抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE 、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验
利用凝胶的分子筛作用，对分子 量不同的蛋白质进行分离
4、离子交换层析法：
原理：利用一些带离子基团的纤维素 或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋 白质抗原。各种蛋白等电点不同， 所带电荷量不同，与纤维素结合能 力有差别。逐步增加洗脱液离子强 度，梯度洗脱。
离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换 凝胶、离子交换树脂
二、抗血清的保存
2℃～8℃保存：短期保存 冰冻保存：保存5年 真空干燥保存：保存5～10年
第五节 抗血清的纯化
抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的 混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目 的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些 不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰 试验结果。
抗血清中为什么有杂抗体？ 1. 免疫原不纯 2. 动物自然免疫
二、佐剂的作用机制
1、改变抗原物理性状，延缓其降解和排 除，更有效刺激免疫系统。
2、刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理 和提呈抗原的能力。
3、刺激淋巴细胞增殖和分化。
三.佐剂应用原则
应用佐剂的目的：
增强抗原的免疫原性,提高免疫应答水平,制
备出高效价的抗体。
使用佐剂的缺点：
1.抗血清特异性减低 2.局部可形成肉芽肿和无菌性脓肿 3.反复注射易发生超敏反应,或局部坏死甚
一、颗粒性抗原的制备
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵
细胞性抗原制备
1.绵羊红细胞抗原的制备程序:
2000r/min
绵羊颈静脉采血抗凝
弃上清
Fra Baidu bibliotek
5分
液
无菌生理盐水洗3次 每次2000r/min
10分
弃去上清液
用 0.9% NaCl配成实
验室所需浓度供使用（2—5%或106/ml）
特异性IgG抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、 离子交换层析法、亲和层析法等；制备单价特异性抗 血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。
透析除去未反应
的半抗原
得人工免疫原 （半抗原+载体）
2.戊二醛法：
半抗 原氨 基
N-CH-(CH2)3-CH-N
载体 氨基
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与 抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
第三章 免疫原和抗血清的制备
第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备
第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制
第三节 抗血清的制备 一、免疫动物的选择 二、免疫程序 三、动物采血法
第四节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存
（三）纯化抗原的鉴定
蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法 分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤 纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电 泳、等电聚焦、高效液相层析 免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA
1.碳化二亚胺法：
半抗原+载体+碳化二亚胺 搅拌
1——2h
置室温24h
多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗 原刺激多种B淋巴细胞克 隆产生的多种抗体的混合 物
多克隆抗体的产生示意图
一、免疫动物的选择
抗原来源与动物种属的关系
种属差异越远，免疫原性越强 常用动物：家兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊、马
动物个体的选择
适龄、健康、体重符合要求
抗原的性质
物结合； ⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。
• 最常用的支持物是Separose4B
(2)配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。
(3)抗原或抗体与支持物的结合： ①活化：溴化氰可活化Separose4B ； ②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨 基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、 重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。
小结
免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的 物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质， 与载体结合后可具有免疫原性。
免疫佐剂是先于抗原或与抗原一起注入机体，可增 强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类 型的物质。
抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有多种抗 原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并 产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗 体。
一、特异性IgG抗体
盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法 凝胶过滤法：常结合盐析法 离子交换层析法：DEAE纤维素、QAE-sephadex、QAE纤维 素 亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层 析柱
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
2、选择性沉淀法：
原理：根据蛋白质理化特性的差异，采用各 种沉淀剂或改变某些条件，促使蛋白质抗原 成分沉淀。从而达到纯化的目的。
核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素 盐析法－硫酸铵、硫酸钠。是经典的方法 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇
优点是：简单方便。 缺点是：纯度不高
3、凝胶过滤法
2.细菌细胞抗原的制备程序:
选择标准菌种
在适宜条件下培
养增殖
以无菌生理盐水刮取洗下
菌苔 革兰染色镜检，验证无杂菌
以无菌生理盐水稀释至所需浓度
加温杀灭（100C02—2.5h）
无活
菌试验合格后
以生理盐水配成
8—10亿/ml
最后检查合格、封装、
保存备用。
二、可溶性抗原的制备和纯化
（一）可溶性抗原的制备
可溶性抗原有: 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、
脂多糖、外毒素、核酸等。
1、组织细胞抗原的制备：
制备程序：
新鲜或低温保存材料 去包膜和结缔组织
用含0.5%/LNaN3的生理盐水灌洗
冷
浴中洗净，剪成碎块，粉碎处理
细
胞破碎处理
组织匀浆
3000r/min10分
取上清液
3000r/min10分
使上清液澄清透明
一、佐剂的种类
化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂以及人工 合成的多聚肌苷酸∶ 胞苷酸(poly I∶C)、脂质体
生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日 咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白
用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细 胞因子、热休克蛋白 常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)
免疫期间应给予充分营养，分笼饲养标明 记号、做好记录。
二、免疫程序
免疫原的剂量
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 特异性要求高，应小量短程，可溶性抗原加用佐剂。对效价 要求高，则可大量长程加佐剂。
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结
抗血清：用免疫接种方法制备的含抗体血清习惯上 称为抗血清（antiserum）也称免疫血清。
例如：Ag 1→家兔→Ab1（一抗） →绵羊→羊抗兔Ig（二抗） Ag 2→家兔→Ab2（一抗）
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 并能与抗体发生反应的物质
颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫 可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸
有关概念
免疫原：指用于接种动物，使之产生抗体的抗原。
第一抗体：用已知的免疫原接种于人或动物，机体 会产生与之相应的、存在于血清中的抗体，这种抗 体在实验中常称为第一抗体（简称一抗Ab1）。
第二抗体：由于Ig有同种型抗原特异性，将人Ig接种 动物或将动物Ig接种异种动物可制备出抗抗体，又 称第二抗体(简称二抗Ab2）。
第五节 抗血清的纯化 一、特异性IgG抗体 二、单价特异性抗血清
思考题 小结
• 制备高效价、高特异性、高亲和 力的抗体，是很重要的技术。而 制备纯的、理想的抗原是制备特 异性抗体的先决条件。制得的抗 体又可以用于纯化和检测抗原。
纯化和检测
纯的理想的抗原 免疫 动物 获得 高 效价、高特异性、高亲和力的抗体
使包膜的渗透压改变而溶解。
优点是: 作用温和 适用于:破碎细菌、破碎细胞（提取核酸)
3、免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法－改变pH 、利用强变 性剂 共价键解离法－氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法－木瓜酶 、胃蛋白酶
IgG片段的制备
1.酶裂解法：
IgG
木瓜酶
Fc+2Fab
Fc段可用于制备抗重链血清。
原混合液制成固相吸附剂
思考题
1．什么是免疫原？ 2．如何制备可溶性抗原？ 3．常用的细胞破碎方法有哪些？ 4．连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方
法有哪些？ 5．纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？ 6．什么是免疫佐剂？免疫佐剂有哪些种类？免疫佐剂的
作用机制有哪些？ 7．什么是抗血清？什么是多克隆抗体？ 8．如何制备抗血清？ 9．动物采血有哪些方法？ 10．抗血清的鉴定包括哪些内容？
即为提取可溶性抗原的材料
组织粉碎的方法： 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎
研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
2、组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：
病理细胞 传代细胞 等 正常细胞
细胞破碎处理
细胞破碎技术
反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化 超声破碎法－超声波（1～20kHz） 自溶法－自身酶系 酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、 二乙基十六烷基溴
1、冻融法:
原理：突然冷冻，胞内形成冰晶， 及胞内外容积浓度的突然改变而破 坏。
方法：反复冻溶两次。 适用于: 组织细胞（最常用方法）
2. 酶处理法:
常用的酶：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶。
适用于: 多种微生物细胞的破碎。 优点是: 作用条件温和，内含物成分不
易破坏，细胞壁破坏程度可控制。
3、超声破碎法:
(4)亲和层析条件的选择： ①封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺 过柱； ②除去未结合和结合不牢的蛋白：先用 NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理；
解脱剂：3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、 0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液
6、电泳法： 利用蛋白质分子量和电荷量不同，在电场中
的迁移率不同，进行分离。
至动物死亡。
抗血清制备的一般程序：
纯化抗原与佛氏佐剂充分乳化 选择合适的动物注射（剂量、次数、 途径） 时间 取动物血清测抗体效价 （符合要求），一周后颈动脉放血 分离血清 鉴定、纯化、保存、备 用。
（一）试血及加强注射 什么是试血？ 试血的时间：末次采血后5-7天 对抗血清效价的要求： ﹥1 ：16