实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测

实验七细菌的药敏试验及耐药性检测

【目的和要求】

1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。

2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。

3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。

【试剂与器材】

1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。

2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。

3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。

4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：

0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml

0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml

将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。

5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。

【实验容】

一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验

1．原理

将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。

K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。

2．方法

（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。

（2）试验菌液准备：将待测细菌接种于普通琼脂平板，35℃培养16~18h，然后从平板上挑取数个菌落，于2~3ml无菌生理盐水中混匀后与0.5麦氏比浊管比浊，调整浊度与标准比浊管相同，其细菌浓度相当于108 CFU/ml。

（3）细菌接种：用无菌棉拭蘸取已调试的菌液，在管壁上稍加挤压之后，手持棉拭于M-H琼脂表面均匀划线接种，共划3次，每次将平板旋转60°角，最后沿平板缘涂抹一周，盖上平板，室温下置3~5min待琼脂表面的水分稍干。

（4）贴纸片用无菌镊子夹取药物纸片平贴在种好细菌的琼脂表面，每个平板可贴4~6种药物纸片。纸片放置要均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板边缘的距离应不小于15mm。纸片一旦接触琼脂表面，就不能再移动。

（5）培养：贴好药物纸片的平板应于室温下放置15min，然后翻转平板，放35℃培养18~24h之后观察结果。

3．结果观察和报告

将平板置于黑背景的明亮处，用卡尺从背面精确测量包括纸片直径在的抑菌环直径，测得结果以毫米为单位进行记录，最后参照NCCLS的标准（见附录）进行结果判断，并以敏感（sensitivity）、中度敏感（morderate sensitivity）和耐药（resistant）等程度报告之。

4．注意事项

（1）培养基的成分、酸碱度以及平板的厚度等对试验结果都可以造成影响。购买培养基时应考虑其质量，对每批M-H琼脂平板均需用标准菌株检测，合格后方可使用。制备平板时，注意其厚度并且厚薄要均匀。

（2）药物纸片的贴放要均匀，并且要充分接触琼脂。药物纸片应始终保存在封闭、冷冻、干燥的环境，否则会影响其活性。长期储存须置-20℃的冰箱，日常使用或没用完的纸片应及时放4℃保存，用时须提前1~2 h取出放室温平衡。纸片应在有效期使用。

（3）菌液浓度也可影响试验的结果，浓度大细菌多时抑菌环减小；菌量少时抑菌环则偏大。此外，菌液配好后应在15min用完。

（4）培养温度以35℃为宜。平板的堆放不超过2块，防止受热不均。

（5）试验过程严格按要求操作，严格无菌操作。

（6）抑菌环的测量要仔细、精确。

5．质量控制：以新鲜传代的金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下用与常规试验相同的方法测定对同种抗菌药物的敏感性，标准菌株的抑菌环应在预期的围。如超出了该围，则不能向临床发报告，应及时查出原因，予以纠正。标准菌株应每周用M-H琼脂传代，4℃保存。

6．临床意义：用于临床细菌常规药敏检测，监测细菌的耐药变迁，指导临床用药。

二、试管稀释法

1．原理

将待测细菌种于一系列含有不同浓度抗菌药物的液体培养基中，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）或最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC）。

2．方法

（1）抗菌药物原液的配制：试验用的抗菌药物应为标准的粉剂，选择适宜的溶剂和稀释剂进行溶解和稀释（表7-2），并配成一定浓度（通常为1000U或1000μg/ml）的药物原液。原液以过滤法除菌，小量分装使用，放-20℃以下一般可保存三个月，如果置4℃只能保存一周。

（2）待测菌液的准备：分纯的平板上挑取4~5个菌落，接种于3~5ml M-H肉汤中35℃

培养4~6h，与标准比浊管比浊，校正菌液浓度至0.5麦氏单位之后，再用M-H肉汤按1∶200稀释，并在15min接种。

（3）试验方法：

1）排列试管：取无菌试管10~15支排列于试管架上，除第一管外，其余每管加入M-H 液体培养基1ml。

2）药物稀释：吸取抗菌药物原液（1000μg/ml）5.12ml和液体培养基4.88ml加入一无菌大试管中，充分混合后，从中吸出2ml分别加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混匀后吸出1ml加入到第三管，以此类推直至最后一管，从最后一管吸出1ml弃去；经如此稀释，各管的药物浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03μg/ml；另设培养基对照、待测菌生长对照和质控菌生长对照管。

3）细菌接种：将已准备好的菌液分别加入到上述各试验管和对照管中，每管0.05ml，轻轻旋转混匀。

4）培养：置35℃培养12~18h后观察结果。

3．结果判断及报告

将试管拿出逐一对光观察，凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）。并以MIC报告之。

如果以0.01ml容量接种环从无菌生长的试管中移种一环于血琼脂平板上划线作次代培养，经35℃培养过夜后，观察能杀死99.9%的种入菌的最低药物浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。

4．注意事项

（1）培养基的pH、渗透压和电解质均可影响试验结果。

（2）抗菌药物必须使用标准粉剂，不应使用口服药而影响其含量。配好后的药物原液应在有效期使用。考虑到抗菌药物的效力，不同药物应选择不同的稀释度。

（3）试验过程易污染，应严格无菌操作。

（4）结果应在12~18h观察，培养时间过长，被轻度抑制的部分细菌可能会重新生长，由于某些抗菌药物不够稳定，时间长了其抗菌活性也会降低，甚至消失，从而使MIC增高。

5．质量控制：每次试验应选用金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下作平行试验。如果标准菌株的试验结果超过或低于预期值一个稀释度以上，不应发出临床报告，而应找出差错的原因。

6．临床意义：多用于抗菌药物抗菌效力的测定，新药开发。目前临床的自动化或半自动化的药敏试验多采用与次类似的微量稀释法。

三、部分细菌耐药表型的检测

1．耐甲氧西林葡萄球菌的检测（头孢西丁纸片扩散法）

甲氧西林(methicillin)是一种能耐青霉素酶的半合成青霉素。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)因多了一个由mec Ａ基因编码的青霉素结合蛋白（PBP2α）而对甲氧西林耐药。这种PBP2α不但与β－酰胺类抗生素的亲和力极低，而且具有其他高亲合力青霉素结合蛋白(PBPs)的功能。当其他PBPs