实验6、琼脂糖凝胶电泳

实验六、琼脂糖凝胶电泳

【实验目的】

熟练掌握琼脂糖凝胶的配置和DNA凝胶电泳的方法。

【实验原理】

琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物，琼脂糖凝胶点为40~45℃。当加热至90℃左右时，即可成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，琼脂糖凝胶可区分相差100bp 的DNA片段。为了满足特殊的要求，可选择低溶点琼脂糖(<70℃,低于双链DNA的变性温度)。

带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定的pH值条件下，可解离成带电荷的离子，在电场中向相反的电极移动。分子生物学领域中，琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离、鉴定和纯化DNA及RNA片段的主要方法。该方法操作简便、快速，可以分辨其它方法(如梯密度离心法)所无法分离的片段。直接嵌入荧光染料后，在紫外灯下可直接检出DNA片段所在的位置，如有必要，从凝胶中回收DNA片段，用于各种克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块，在不同的装置上进行电泳。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低，但其分离范围广，约200bp~50kb的DNA。琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。聚丙烯酰胺分离小片段(5~500bp)的效果较好，甚

至可以分辨相差1bp的DNA片段。长度大于10 000kb的DNA片段，可以通过电场方向呈周期性变化，在脉冲电场胶中进行电泳。

【试剂和器材】

试剂：灭菌重蒸水；TE缓冲液；琼脂糖；核酸染料；；DNAmarker；6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油）

器材：移液器；水平电泳槽；电泳仪，枪头，移液器，锥形瓶，微波炉，制胶槽，梳子，水平电泳仪，稳压器，凝胶成像系统

【实验步骤】

（1）称取1 g琼脂糖加入250mL锥形瓶中，量取100 ml 1× TAE电泳缓冲液加入锥形瓶。

（2）微波炉加热并多次摇晃锥形瓶使琼脂糖充分溶解。

（3）待胶冷却至60℃左右加入7 µL的溴化乙锭(EB)，轻摇混匀。

（4）向胶板中倒胶，插上梳子，静置约30 min待凝胶完全冷却。

（5）拔出梳子，将凝胶连同支撑用的模具一起转移到加入了1×TAE电泳缓冲夜的电泳槽中，使电泳缓冲液淹没凝胶，上样。150 V，200mA电泳约20 min。

（6）取出凝胶，扫胶记录电泳结果。

注意事项：

1、加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，并可对着光线肉眼检查凝胶溶解情况，使附着在壁上的颗粒完全溶解。

2、在微波炉上加热时间不要过长，以免引起暴沸。如蒸发过多的溶液，应补充部分缓冲液。

3、气温较高或用低熔点、低浓度（小于0.5%）琼脂糖制胶、倒胶和电泳时，最好在4℃进行。

【实验结果】