无菌、微生物检查法方法学验证实例
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
药品无菌检查方法的验证试验讲义(ppt 27页)
大豆－胰酪胨培养基
培养基灵敏度检查
与方法验证用菌株 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、
黑曲霉
检验方法
只要供试品性状允许，
性状允许的样品均可采用薄膜过滤，
应采用薄膜过滤法
利于抗菌影响去除
稀释剂与
薄膜过滤冲洗液 0.1％蛋白胨水溶液； A、D、K
0.1％蛋白胨水溶液（ 0.1％
• 根据上述验证试验结果可知，氯化 钠注射液的无菌检查，不需冲洗，以金 黄色葡萄球菌为阳性对照菌。本方法适 合于氯化钠注射液的无菌检查，即氯化 钠注射液的无菌检查法通过验证。
六、注意事项
1. 预试验 2. 稀释液与冲洗液: 作用、种类、冲洗量 3. 菌液: 保存、加入方式、加入量 4. 具有抗菌活性的供试品 5.滤膜： 选择、种类 6.对照菌: 根据供试品的特性来选择(抗生素根
的。单倍量重试)
二．方法验证试验建立及要求
验证实际是伴随着整个试验过程， 试验过程中的每一个环节都应该有合理 的证明，以确保在实际检验条件下，该 供试品的无菌检查法的可靠性。
主要内容 怎么做: 一选方法二看性质三除
抑菌性四计菌数五定取样量
• 注意什么: 七注意
怎么做
一 选定试验方法: 可靠、稳定、简便
2005年版无菌检查法主要方面与USP、BP的比较
比较项目
ChP2005
USP29
BP2002
检验条件规定
总体10000级、局部100级
无具体规定
无具体规定
人员要求
无具体规定
正确培训和认可
细菌检查培养基 硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培
养基
无菌检验方法学验证方案
无菌检验 方法学验证方案辽宁爱母医疗科技有限公司 辽宁爱母医疗科技有限公司 2010 年 9 月1文件名称无菌检验方法学验证方案总页数文件编号起草部门起草人起草日期备注审核部门审核人审核意见审核日期生产技术部主管起草部门主管审批部门审批人审批意见审批日期总工办负责人质量部主管2目录 1、验证对象、范围及时间 2、目的 3、实施验证的人员分工及职责 4、可接受标准 5、验证操作方法 6、验证结论 7、结果分析与评价 8、漏项与偏差表 9、再验证周期 10、最终批准 11、附录31、验证对象及范围 本实验是关于产品无菌检查试验的验证。
参照《中国药典2005年版》二 部附录无菌检查方法进行试验。
结果采用直接接种法对人工污染的六种菌株 进行试验，产品对枯草芽孢杆菌、生孢梭菌有不同程度的抑菌作用。
采用薄 膜过滤法用0.9%氯化钠100mL进行样品稀释，然后用500mL的pH7.0氯化钠缓冲 液分几次冲洗，可消除其抑菌成分。
验证结果应显示对产品无菌试验方法。
2、目的 本方案的目的在于为分析评价无菌检验方法，以确认采用适宜的检验 方法。
3、实施验证的人员分工及职责表 1 无菌检验方法学验证小组职责分工验证职责 起草验证方案 起草验证报告 无菌检验方法学验证实施 检 验负责部门负责人审核验证方案和验证报告 批准验证方案和验证报告 4、接受标准 已对生化检验人员进行专业培训。
5、验证操作方法 5、1 概述 本产品为三类医疗器械无菌产品。
无菌检查法是对该产品质量控制的重要 检查项目，《2005年版药典》要求建立产品的无菌检查法时要进行方法学的 验证，来确认所采用的方法适用。
按照《中国药典2005年版》要求，以金葡4球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌，黑曲霉菌作 为实验菌种，对甲磺酸罗哌卡因注射液无菌检查方法进行了验证实验。
5、2 验证主要文件 文件名称 《无菌工作服管理规程》 《初始污染菌检验》 编号AM·SMP·De23-05-I实际情况5、3 无菌服洗衣消毒灭菌程序 适量 纯化水浸泡2 分钟加洗涤剂15 分钟 洗涤脱水0.1 新洁尔灭浸泡 15 分钟纯化水漂洗5 分钟 3 分钟消毒纯化水漂洗脱水121℃，30min晾干放入无菌袋灭菌放入传递窗 5、4 取样缓冲区指定地点将浸有灭菌生理盐水的棉拭子在无菌服的门衣襟、袖上来回涂抹 10 次 （往返为一次）采样面积为 5cm×5cm，将棉拭子放入 10ml 灭菌生理盐水的试 管中。
直接接种无菌检查法验证方案及报告
贵州金玖生物有限责任公司验证方案及报告验证方案名称：直接接种无菌检查方法验证验证方案编号：验证完成日期：有效期：验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日1 概述无菌检查法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。
它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。
基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。
检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。
2 验证目的对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本公司产品的无菌检查。
3 实验原理直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。
本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得出直接接种法无菌检验的有效性。
4 验证范围实用于本公司所采用的直接接种法进行的无菌检验过程验证。
56 职责7 验证内容建立样品组、对照组及菌种活性检查组，接种菌株到指定培养基，培养24~72小时，比较观察菌落的生长状况，得出结论。
8 验证指示物本实验所用菌种为购于贵州食品药品监督管理局标准菌株:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌及生孢梭菌。
9 实验过程（1）培养基的配制用于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的营养琼脂培养基用于白色念球菌的改良马丁培养基用于生孢梭菌的流体硫乙醇酸盐培养基（2）供试品的制备术泰舒TM生物多糖冲洗胶液供试品：直接取成品10ml，加pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试品。
无菌验证方案
4.4.10无菌参照中国药典2010年版二部附录ⅪH 无菌检查法操作并进行方法学验证。
4.4.10.1 验证用培养基硫乙醇酸盐流体培养基，批号；改良马丁琼脂培养基，批号；营养琼脂培养基，批号；营养肉汤培养基，批号；改良马丁培养基，批号；玫瑰红钠琼脂培养基，批号；4.4.10.2 验证用菌种金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]，批号；铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]，批号；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]，批号；生孢梭菌[CMCC（B）64 941]，批号；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]，批号以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。
4.4.10.3 培养基的适用性检查（1）无菌性检查随机取用于实验批次的营养肉汤培养基（30~35℃培养），营养琼脂培养基（30~35℃培养），改良马丁培养基（23~28℃培养）、硫乙醇酸盐流体培养基（30~35℃培养）各5支/瓶，置规定温度的培养箱中培养14天，结果应均无菌生长。
（2）培养基灵敏度检查1）菌液制备取经30~35℃培养18~24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，用0.9%无菌氯化钠溶液以10倍稀释的方式稀释至10-5～10-7，使每ml菌悬液约含50～100cfu菌落数，备用。
取经30~35℃培养18~24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，用0.9%无菌氯化钠溶液以10倍稀释的方式稀释至10-6备用。
取经20~28℃培养24~28小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，用0.9%无菌氯化钠溶液以10倍稀释的方式稀释至10-6，使每ml菌悬液约含50～100cfu菌落数，备用。
2）各菌悬液活菌计数结果活菌计数结果记录于表10-38。
表10-38 活菌计数（cfu/ml）10－5稀释10－6稀释10－7稀释均数试验次数 1 2 3 1 2 3 1 2 3金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌铜绿假单胞菌白色念珠菌3）培养基接种取无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基9支，每支12ml，分别接种上述活菌计数结果约为50～100cfu/ml的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，每支接种菌悬液1ml，另一支不接种作为空白对照，在30~35℃培养3天。
聚乙烯醇滴眼液的无菌检查方法验证实验
聚乙烯醇滴眼液的无菌检查方法验证实验【摘要】目的建立聚乙烯醇滴眼液的无菌适用性检查试验。
采取的试验方法，严格按照2020年版四部药典1101无菌检查法项下的方法适用性试验的各项具体方法和要求操作。
本篇论文经过多次试验后，确定采用薄膜过滤法作为本品无菌试验用检查具体方法，无需冲洗液。
阳性管加入金黄色葡萄球菌，生长良好，无抑菌效应。
先后平行三次试验，共试验9批次，重复性、重现性、回收率都很稳定，试验组样品管、培养基空白对照管、都没有菌生长，表明该试验方法确定下的各项检验条件是最佳试验方法。
结论：本论文项下的各种条件、实验方法、参数简单、可靠，可以确定为本产品的无菌检查适用性方法。
【关键词】聚乙烯醇滴眼液；无菌检查法；方法验证Validation of asepsis test for compound racemic anisodamine eye drops【Abstract】objective to establish a test for the sterility applicability of compound racemic anisodamine eye drops. The test methods adopted strictly follow the specific methods and requirementsof the applicability test of the method under the asepsis test method 1101 of the four-part pharmacopoeia (2020 edition). In this paper,after many tests, the membrane filtration method was determined to be adopted as the specific test method for the sterility of the product, without the need for washing liquid. Positive tube addedstaphylococcus aureus, growth is good, no bacteriostatic effect. Three parallel tests were carried out successively, with 9 batches in total.The repeatability, reproducibility and recovery rate were stable. Inthe test group, there was no growth of bacteria in the sample tube and the blank culture medium, indicating that the test conditions determined by this test method were the best test methods.Conclusion: the conditions, experimental methods and parameters under this paper are simple and reliable, which can be determined asthe applicable method for sterility inspection of this product.【Key words】 Glucose and sodium chloride injecion Asepsis check Means certification1 无菌检查法从批量生产的产品中随机抽取本品（规格5ml：消旋山莨菪碱1.0mg与硫酸软骨素0.1g）[1]30瓶，采用薄膜过滤的方法，全部抽入三联体过滤器中，以120转/分的转速抽滤，在过滤器中先加入50毫升的稀释液，润湿，再将供试液全部抽滤完，过滤结束后，不需再用稀释液冲洗过滤，再分别在其中的两管中各加入硫乙醇酸盐流体培养基100毫升，其中的一管作为阳性对照管，并用注射器加入1毫升52cfu/ml的金黄色葡萄球菌用来做阳性对照试验；第三管中加入100毫升TSB培养基；其中两管在35℃培养，另一管在25℃培养，每日观察实验结果，并记录。
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
无菌检查方法验证报告
无菌检查方法验证报告目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 接受标准 (3)4. 抽样计划 (3)5. 设备、试剂和菌种信息 (3)6. 试验步骤 (4)7. 供试品检查 (6)8. 结论 (6)9. 再验证周期 (6)10. 附件清单 (6)1.目的支据中国药典2020版无菌检查法的要求，对产品的无菌检查法进行验证，以确定一种无菌检查的方法能有效的消除该产品对微生物的抑制作用，从而证实该方法的有效性和实用性。
2.适用范围适用于本司产品的无菌检查。
3.接受标准与阳性对照比较，含供试液各容器中的试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉）均生长良好，则可照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。
如含供试品的任一容器内的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需进一步改进检验条件再进行方法验证试验。
4.抽样计划随机抽取灭菌后的样品24份。
具体信息见表一：表一样品信息确认人/日期：复核人/日期：5.设备、试剂和菌种信息5.1设备信息详见表二表二设备信息确认人/日期：复核人/日期：5.2试剂信息详见表三：表三试剂信息确认人/日期：复核人/日期：5.3菌种信息详见表四：表四菌种信息确认人/日期：复核人/日期：5.3.1菌液的制备用接种环取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取生孢梭菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的第四代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的第三代培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
以上操作均在微生物检验室阳性菌室的生物安全柜中进行。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
注射用万古霉素无菌检查方法学验证
试验样品处理
试验步骤
按照无菌检查方法学的要求，对试验样品进行处理，包括稀释、加 药、培养等步骤。
操作规范
在处理试验样品的过程中，需要严格遵守无菌操作规范，避免样品 中的微生物污染实验环境。
数据记录
记录每个试验样品的无菌检查结果，包括微生物种类、数量等。
03
方法学验证实验
样品准备
取注射用பைடு நூலகம்古霉素样品，用无菌方法将样品分别装入无菌容器中。
注射用万古霉素无菌检查方 法学验证
汇报人：
日期:
• 引言 • 方法学验证方案 • 方法学验证实验 • 方法学验证结果分析 • 注射用万古霉素无菌检查方法学验
证总结
01
引言
目的和背景
目的
确保注射用万古霉素的无菌检查方法具有可靠性、准确性和可重复性，为产品质量控制提供有力支持 。
背景
注射用万古霉素是一种广泛应用于临床治疗的抗生素药物，其无菌质量对于保障患者安全具有重要意 义。因此，对无菌检查方法进行验证是保证药物安全性的关键环节。
参考标准
《中国药典》2020年版
规定了注射用万古霉素的无菌检查方法和要 求。
《无菌检查法》国家药品标 准
提供了无菌检查方法学的通用指导原则。
《微生物限度检查法》国 家药品标准
提供了微生物限度检查的方法学指导原则。
定义与术语
无菌检查
01
指对药物中是否含有微生物的检查方法，是确保药物
无菌的重要手段。
实验设计
根据无菌检查方法学验证指导原则，设计实验方案，包括实验组和对照组。
实验操作
按照实验设计方案，分别对实验组和对照组进行无菌检查实验。
培养与观察
将实验组和对照组的培养皿放入无菌培养箱中培养 ，每天观察并记录培养结果。
微生物方法学验证
速效心痛滴丸2.微生物限度检查参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 0032.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。
2.1.3操作方法：（1）菌液制备：a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。
（3）回收率测定a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。
b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。
c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。
d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。
4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：表2 菌落计数（cfu/ml）从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
5种医院制剂微生物限度检查法的方法学验证
中国药业 !"#$% &"%’(%)*+,#)%-.
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药物鉴定
2 批号为 !""+"/,!4 !""+"/,04 !""+"/,1 3 ， 一方散 2 批号为 !""+"/!14 风湿散 2 批号为 !""+"/,*4 !""+"/!,4 !""+"/!/3， !""+"/!)4 !""+"//" 3， 外敷一号液 2 批号为 !""+"/"!4 !""+"/,*4 !""+"//" 3 ， 均为广西玉 林市骨科医院制剂。 培养基与稀释剂： 培养基包括营养琼脂培养基、 玫瑰红钠琼脂 培养基、 营养肉汤培养基、 硫乙醇酸盐流体培养基、 胆盐乳糖培养 （.5） 、 改良马丁培养基、 改良马丁琼脂培养基、 甘露醇氯化钠琼 基 脂培养基、 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基。 稀释剂为 67 8 +9 " 的 无菌氯化钠 : 蛋白胨缓冲液、 "9 *’ 无菌氯化钠溶液等。 仪器： 霉菌培养箱。 ;7< : !-" 型生化培养箱， ! !" # 方法与结果 菌液制备 大肠埃希菌、 枯 取 /- = 下培养 ,) > !0 ? 的金黄色葡萄球菌、 草芽孢杆菌、 铜绿假单胞菌的营养肉汤培养物， 用 "9 *’ 无菌氯化 钠溶液制备成每 , @5 含菌数为 -" > ,"" #$% 的菌悬液， 备用； 取 !+ = 下培养 !0 > 0) ? 的白色念珠菌改良马丁培养基培养物， 用 "9 *’ 无菌氯化钠溶液制备成每 , @5 含菌数为 -" > ,"" #$% 的菌悬液， 备用； 取 !+ = 下培养 - > + A 的黑曲霉改良马丁琼脂培养基斜面培 养物， 用 "9 *’ 的无菌氯化钠溶液 - @5 洗下霉菌孢子， 吸取孢子悬 液， 置无菌试管内， 用 "9 *’ 无菌氯化钠溶液制备成每 , @5 含孢子 备用。 数为 -" > ,"" #$% 的孢子悬液， !" ! 供试品溶液制备 !" & 取跌打散、 十味散、 一方散、 风湿散各 ," B， 加 67 为 +9 " 的无 菌氯化钠蛋白胨水缓冲液至 ,"" @5， 混匀即得 , C ," 的溶液， 作为 供试品溶液。 对于外敷一号液， 则取原液作为供试品溶液。 !" $ 回收率预试验 为确定细菌、 霉菌和酵母菌菌落数的测定方法， 选用敏感菌 株金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌， 分别用常规法、 培养基稀释法 （"9 - @5 & 皿 ） 对供试品进行预试验。 常规法： 取平皿， 分别注入供试品溶液和菌悬液各 , @5， 每株 菌平行做 ! 个皿， 再加入相应的培养基， 依法培养， 进行菌落计数。 （"9 - @5 & 皿） 培养基稀释法 ： 取平皿， 分别注入供试品溶液 "9 - @5 和菌悬液 , @5， 每株菌平行做 ! 个皿， 再加入相应的培养基， 依法 培养， 进行菌落计数。 结果： 见表 , 。 可见， 跌打散、 十味散、 一方散、 风湿散采用常规 法检查， 金黄色葡萄球菌及白色念珠菌回收率均大于 +"’ ， 达到 《 中国药典 》 要求， 予以采用； 外敷一号液采用常规法检查， 金黄色 葡萄球菌回收率均小于 +"’ ， 白色念珠菌回收率均大于 +"’ ， 因 此霉菌及酵母菌检查可采用常规法， 而细菌检查须采用培养基稀 （"9 - @5 & 皿 ） 进一步预试。 预试结果显示， 金黄色葡萄球菌回 释法 《中国药典 》 收率为 ),’ ， 达到了 要求， 予以采用。
注射用克林霉素磷酸酯无菌检查的方法验证(1)0.3g
注射用克林霉素磷酸酯无菌检查方法及其验证报告为保证新生产的注射用克林霉素磷酸酯无菌检查的结果的准确可靠，现特对注射用克林霉素磷酸酯进行了无菌检查方法的修订及验证工作。
新拟定的检查方法及验证结果如下：1、实验用品：供试品：注射用克林霉素磷酸酯（批号：规格：0. 3g／支）样品来源：仪器、滤器和设备：HTY-III型智能集菌仪、全封闭集菌培养器KDGB220 KDGB330，均由杭州高得泰林医疗器械有限公司制造。
HNZ-1-1垂直流形超净工作台（南通沪南科学仪器有限公司）；YXQ-SG41.280电热手提式压力蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂）；HH·B11·500电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；HP250MJ-B霉菌培养箱（武汉瑞华仪器设备有限责任公司）；DGH140-B型电热鼓风干燥箱（武汉瑞华仪器设备有限责任公司）等。
培养基：硫乙醇酸盐培养基，批号：091020；改良马丁培养基，批号：090911；营养肉汤培养基，批号：090922；营养琼脂培养基，批号：091102；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：090601；蛋白胨，批号：080121；上述培养基均来源于北京三药科技开发公司。
均按照《中国药典》2010年版二部附录XI H 无菌检查法项下要求配制。
冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液，按照《中国药典》2010年版二部附录XI H无菌检查法项下要求配制。
验证试验用菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]金黄色葡萄球菌[CMC（B）26 003]大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]生孢梭菌[CMCC（B）64 941]黑曲霉菌[CMCC（F）98 003 ]白色念珠菌[CMCC（F）98 001]上述菌种均来自湖北省药检所。
均符合中国药典》2010年版二部附录XI H无菌检查法项下要求。
2、预试验小结：检查方法选择：根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪH无菌检查法方法要求首选薄膜过滤法。
2022版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程
2022版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，2.每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏1大肠埃希菌2金黄色葡萄球菌3枯草芽孢杆菌4生孢梭菌5铜绿假单胞菌6沙门菌（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间）7白色念珠菌8黑曲霉菌（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。
恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：1.回收率验证：回收率验证实验共需要26天（若回收率达不到药典规定需要重新选用另一种方法进行验证）五种实验菌分别验证1金黄色葡萄球菌2铜绿假单胞菌3枯草芽孢杆菌4白色念珠菌5黑曲霉菌五种阳性菌的回收率验证需使标准阳性菌回收率在阳性对照组计数达到50％-200％之间假设验证一次成功3种细菌回收率各需要4天时间，2霉菌酵母菌各需要7天时间2.控制菌适用性验证：共需要20天大肠埃希菌控制菌方法：需要5天时间其他制剂含药材原粉的中药制剂需要检查沙门菌、耐胆盐革兰式阴性菌各需要7天时间共1周实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等方法学验证一次顺利完成共需要46天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认复方茵陈注射液无菌方法学适用性验证：1.方法适用性验证：验证实验共需要30天（若回收率失败或达不到药典规定回收率需要重新选用方法进行验证）五种实验菌分别验证1金黄色葡萄球菌2大肠埃希菌菌3枯草芽孢杆菌4生孢梭菌5白色念珠菌6黑曲霉菌6种实验组阳性菌需与对照管组进行对照,含供试品的实验菌均生长良好则说明方法可行假设验证一次成功每种菌分别按规定温度培养，培养时间不得超过5天实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等，方法学验证一次顺利完成共需要30余天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认。
2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明
中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉 末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性 菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以 验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影 响试验结果
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
微生物方法学验证范本
编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案起草人：年月日审核人：年月日年月日年月日批准人：年月日目录1.验证立项表2.验证内容2.1验证目的2.2验证范围2.3验证要求2.4验证方法2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容2.4.3金黄色葡萄球菌验证内容2.4.4铜绿假单胞菌验证内容3.验证报告验证立项表（REC）XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。
根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。
2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。
3.判定标准3.1验证小组成员3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%,假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q,则0.7W Q W1.3。
3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。
3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。
4.验证方法4.1试验原料、稀释剂和标准微生物4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。
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验证实例
2020/8/10
1
虎杖苷注射液无菌检查的方法验证
• 样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司 提供，批号20040305。
• 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，
批号040203；霉菌液体培养基，批号 040302； 营养肉汤培养基，批号 0403045；营养琼脂培 养基，批号 040513；0.1%蛋白胨溶液，批号 050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由 中检所所培养基室提供。
(3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102]；
(4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]；
（5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]；
(6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]；
2020/8/10
19
将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至 改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃ 培养5～7d，使大量的孢子成熟 。取经 25℃培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加 入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空 试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加 生理盐水10ml混匀备用。
2020/8/10
• β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号： 20030630）
2020/8/10
14
验证试验用菌种：
（1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]；
(2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]；
铜绿假单胞菌
47 50
2020/8/10
7
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8 支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基 2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌 液（30-100个/ml），置规定温度培养 3-5天，逐日观察结果。
2020/8/10
8
薄膜过滤法：
取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3 联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗 500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、 枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释 剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性 菌的验证滤筒置37℃培养3～5d，逐日观察， 结果见表2、3、4。
薄膜过滤：将规定量的供试品按薄 膜过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在 最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌 少 于 100CFU 。 按 规 定 将 培 养 基 直 接 加至滤筒内。每天观察并记录结果。
取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇 酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水 ，10倍稀释至10-6，混匀备用。
2020/8/10
18
白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁 培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3], 25.5±2.5℃培养24～48小时。
取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌 真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子 ，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml 生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理 盐水9ml，混匀备用。
20
菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加 入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养 琼脂约18ml。30~35℃培养（生孢梭菌置厌 氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌 液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。 注入虎红琼脂约18ml。23~28℃培养。
2020/8/10
21
供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
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头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证
• 样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶； 批号：40807001；生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH
• 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、 营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、 虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基 室提供)
2020/8/10
9
2020/8/10
10
2020/8/10
11
2020/8/1012 Nhomakorabea结论：
根据上述结果，由于采用直接接种 法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑 制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检 查应依据中国药典无菌检查方法中的薄 膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。
2020/8/10
5
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋 白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
2020/8/10
6
10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
80 76
(7) 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。
2020/8/10
15
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无 菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛 牛基因有限公司。
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实 验
2020/8/10
16
操作方法
菌液制备：
2020/8/10
2
取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙 醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化 钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。
取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加 0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另 一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～ 100cfu/ml备用。
取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大 肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许 接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜 培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
2020/8/10
17
取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大肠 埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐 水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。