无菌、微生物检查法方法学验证实例
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薄膜过滤：将规定量的供试品按薄 膜过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在 最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌 少 于 100CFU 。 按 规 定 将 培 养 基 直 接 加至滤筒内。每天观察并记录结果。
取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大 肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许 接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜 培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
2020/8/10
17
取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大肠 埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐 水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。
2020/8/10
5
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋 白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
2020/8/10
6
10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
80 76
2020/8/10
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将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至 改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃ 培养5～7d，使大量的孢子成熟 。取经 25℃培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加 入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空 试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加 生理盐水10ml混匀备用。
202ห้องสมุดไป่ตู้/8/10
(7) 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。
2020/8/10
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仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无 菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛 牛基因有限公司。
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实 验
2020/8/10
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操作方法
菌液制备：
2020/8/10
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取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙 醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化 钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。
取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加 0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另 一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～ 100cfu/ml备用。
铜绿假单胞菌
47 50
2020/8/10
7
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8 支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基 2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌 液（30-100个/ml），置规定温度培养 3-5天，逐日观察结果。
2020/8/10
8
薄膜过滤法：
取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3 联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗 500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、 枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释 剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性 菌的验证滤筒置37℃培养3～5d，逐日观察， 结果见表2、3、4。
取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇 酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水 ，10倍稀释至10-6，混匀备用。
2020/8/10
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白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁 培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3], 25.5±2.5℃培养24～48小时。
取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌 真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子 ，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml 生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理 盐水9ml，混匀备用。
• β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号： 20030630）
2020/8/10
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验证试验用菌种：
（1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]；
(2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]；
2020/8/10
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头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证
• 样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶； 批号：40807001；生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH
• 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、 营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、 虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基 室提供)
无菌检查、微生物 限度检查 方法学
验证实例
2020/8/10
1
虎杖苷注射液无菌检查的方法验证
• 样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司 提供，批号20040305。
• 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，
批号040203；霉菌液体培养基，批号 040302； 营养肉汤培养基，批号 0403045；营养琼脂培 养基，批号 040513；0.1%蛋白胨溶液，批号 050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由 中检所所培养基室提供。
20
菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加 入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养 琼脂约18ml。30~35℃培养（生孢梭菌置厌 氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌 液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。 注入虎红琼脂约18ml。23~28℃培养。
2020/8/10
21
供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
2020/8/10
9
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10
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11
2020/8/10
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结论：
根据上述结果，由于采用直接接种 法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑 制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检 查应依据中国药典无菌检查方法中的薄 膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。
(3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102]；
(4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]；
（5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]；
(6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]；
取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大 肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许 接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜 培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
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取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大肠 埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐 水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。
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供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋 白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
2020/8/10
6
10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
80 76
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将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至 改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃ 培养5～7d，使大量的孢子成熟 。取经 25℃培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加 入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空 试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加 生理盐水10ml混匀备用。
202ห้องสมุดไป่ตู้/8/10
(7) 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。
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仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无 菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛 牛基因有限公司。
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实 验
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操作方法
菌液制备：
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取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙 醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化 钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。
取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加 0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另 一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～ 100cfu/ml备用。
铜绿假单胞菌
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方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8 支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基 2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌 液（30-100个/ml），置规定温度培养 3-5天，逐日观察结果。
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薄膜过滤法：
取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3 联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗 500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、 枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释 剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性 菌的验证滤筒置37℃培养3～5d，逐日观察， 结果见表2、3、4。
取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇 酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水 ，10倍稀释至10-6，混匀备用。
2020/8/10
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白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁 培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3], 25.5±2.5℃培养24～48小时。
取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌 真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子 ，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml 生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理 盐水9ml，混匀备用。
• β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号： 20030630）
2020/8/10
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验证试验用菌种：
（1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]；
(2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]；
2020/8/10
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头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证
• 样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶； 批号：40807001；生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH
• 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、 营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、 虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基 室提供)
无菌检查、微生物 限度检查 方法学
验证实例
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虎杖苷注射液无菌检查的方法验证
• 样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司 提供，批号20040305。
• 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，
批号040203；霉菌液体培养基，批号 040302； 营养肉汤培养基，批号 0403045；营养琼脂培 养基，批号 040513；0.1%蛋白胨溶液，批号 050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由 中检所所培养基室提供。
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菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加 入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养 琼脂约18ml。30~35℃培养（生孢梭菌置厌 氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌 液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。 注入虎红琼脂约18ml。23~28℃培养。
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供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
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结论：
根据上述结果，由于采用直接接种 法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑 制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检 查应依据中国药典无菌检查方法中的薄 膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。
(3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102]；
(4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]；
（5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]；
(6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]；