酶免疫测试(EIA)技术
酶免疫分析法
免疫分析法（immunoassay，IA）是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。
由于疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。
1、酶免疫分析（EIA）酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。
这种方法是对细胞融合技术的一项重要应用。
因其操作简便，不需昂贵设备，不污染环境，加之酶标记物相当稳定，有效期长，应用范围广泛而受环境检验工作者青睐。
最初应用的EIA技术，多采用HRP标记抗体或抗原，灵敏度不高。
后来逐步发展了各种放大体系，如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系，以及采用PCR技术的PCR-EIA分析，使灵敏度有很大改进。
1.1生物素-链亲和素酶免分析（biotin avidin system BAS-EIA）[1]生物素（botin）广泛存在于动植物组织中，在生物体内是羧化酶的辅酶；亲合素又名抗生物素蛋白，与生物素具有高度的亲和性，利用这一点，以生物素和亲和素为中介，可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。
但亲和素的非特异性结合高，后又发现另一种亲合素，称之为链亲合素（Streptavin，SA），克服了亲合素非特异性结合高的缺点。
免疫分析技术中，目前均采用SA供标记酶或其它示踪剂。
一个完整的SA分子上的4个相同亚基，都可以和一个生物素分子结合，其Ka值达1015L/mo1，是抗体抗原反应的10~100万倍。
又加之一个抗体或抗原分子结合多个生物素分子，不改变其免疫活性。
1.2脂质体免疫分析法（liposome immunoassay，LIA）[1]脂质体是一种生物摸拟膜，它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双子单层或多层的囊泡。
其膜内可包容上万个标记物分子，具有很高的信号放大作用。
酶免疫技术的实验报告
酶免疫技术的实验报告实验目的：本实验旨在通过酶免疫技术（Enzyme Immunoassay, EIA）来检测特定抗原或抗体的存在，了解其原理和应用，提高实验操作技能。
实验原理：酶免疫技术是一种利用酶标记的抗体或抗原进行检测的方法。
它结合了酶的催化活性和免疫反应的特异性，通过酶的催化作用放大信号，提高检测的灵敏度。
常用的酶免疫技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）等。
实验材料：1. 待测样本：含有目标抗原或抗体的生物样本。
2. 酶标记的抗体或抗原：用于与待测样本特异性结合。
3. 酶底物：与酶反应产生可检测的信号。
4. 标准品：用于建立标准曲线，定量分析。
5. 洗涤液：用于去除未结合的酶标记物。
6. 酶标仪：用于测定吸光度或荧光强度。
实验步骤：1. 准备实验所需的试剂和材料，包括待测样本、酶标记物、酶底物、标准品等。
2. 根据实验设计，选择合适的ELISA方法（直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA等）。
3. 将待测样本和标准品按照一定比例稀释，并加入到预先包被的酶标板中。
4. 孵育一定时间后，用洗涤液清洗酶标板，去除未结合的样本和酶标记物。
5. 加入酶底物，使酶催化底物产生可检测的信号。
6. 在酶标仪上测定吸光度或荧光强度，记录数据。
7. 根据标准品的吸光度或荧光强度，建立标准曲线，计算待测样本中目标抗原或抗体的浓度。
实验结果：通过实验操作，我们得到了以下结果：- 标准曲线的建立：根据标准品的吸光度或荧光强度，绘制出标准曲线，其线性关系良好。
- 待测样本的定量分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标抗原或抗体的浓度。
实验讨论：在本实验中，我们成功地应用了酶免疫技术来检测特定抗原或抗体的存在。
实验结果表明，酶免疫技术具有较高的灵敏度和特异性，适用于生物医学研究和临床诊断。
然而，实验过程中也存在一些局限性，如酶标记物的稳定性、非特异性结合等问题，需要进一步优化实验条件。
实验结论：通过本次实验，我们掌握了酶免疫技术的原理和操作流程，能够利用该技术进行生物样本中特定抗原或抗体的检测。
酶免疫测定技术PPT课件
检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
编辑版ppt
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、编辑版中ppt等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
酶免疫技术
酶免疫技术（Enzyme Immunoassay，EIA）了解：1.酶免疫技术中相关技术环节2.酶免疫测定的应用理解：1.酶免疫技术的分类、测定原理及主要类型2.酶免疫技术的特点掌握：ELISA的基本原理、主要类型、方法、步骤、结果判断一、酶免疫技术概述（一）基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。
EIA：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化的专一性（二）基本特点：1.①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性2.②酶促反应专一性，保证特异性3.③底物反应放大作用，提高敏感性4.④酶标试剂保存稳定5.⑤操作简便，安全易行（三）主要试剂的制备与要求：1.酶与酶作用底物(1)用于标记酶的要求：①酶活性高②标记后酶活性稳定,不影响抗原抗体的免疫反应性③酶催化底物后信号易判定或测定④酶活性不受样品中其他成分的影响⑤酶、辅因子及底物理化性质稳定,安全无害、价廉2.酶标记抗体或抗原(1)通过化学反应或者免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。
(2)酶结合物（conjugate）：①酶免疫技术的核心组成部分②直接影响酶免疫技术的应用效果③它的制备是酶免疫技术中非常关键的一个环节①戊二醛交联法②改良过碘酸钠法（直接法）3.固相载体目的：分离游离和结合的酶标志物(1)基本要求①结合容量高，结合稳定②可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合③生物大分子固化后仍保持活性④固化方法简便易行、快捷经济(2)固相载体的种类与选择1)塑料制品（聚苯乙烯）：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用2)微颗粒（免疫磁珠）：结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析3)膜载体（western-blot）：硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA (3)包被与封闭1)包被（coating）：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程，一般采用偏碱（pH 9.6）的碳酸盐溶液2)封闭（blocking）：1％-5％牛血清白蛋白或5％-20％小牛血清，再包被以消除固相载体未覆盖位点产生的非特异干扰二、酶免疫技术的分类（一）均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。
免疫缺陷性疾病的免疫酶标法(EIA)检验技术综述
免疫缺陷性疾病的免疫酶标法（EIA）检验技术综述免疫缺陷性疾病指的是机体免疫系统功能异常或缺陷所导致的疾病。
早期的诊断和治疗对于改善患者的预后至关重要。
而免疫酶标法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称EIA）作为一种常见的实验室检测技术，能够提供快速、灵敏和特异的免疫分析结果。
本文将综述免疫酶标法在免疫缺陷性疾病检测中的应用及其技术原理。
一、免疫酶标法的概述免疫酶标法是一种通过酶的催化作用来检测和定量抗原或抗体的方法。
它结合了酶学和免疫学的原理，具有高度敏感性和特异性。
常见的免疫酶标法包括间接免疫酶标法、夹心法、竞争法等，这些方法基本相同，只是在具体操作步骤上略有区别。
二、EIA在疾病诊断与监测中的应用1. HIV/AIDS的检测与监测HIV/AIDS是一种严重的免疫缺陷性疾病，EIA被广泛应用于其早期诊断与病毒载量监测。
在早期感染阶段，患者体内的抗体水平相对较低，传统的抗体检测方法可能无法及时发现感染。
而EIA通过检测抗原或病毒核酸来提高检测敏感性，缩短窗口期。
2. 免疫缺陷病毒感染的诊断免疫缺陷病毒（Immunodeficiency Virus，简称HIV）可以导致机体免疫系统功能受损。
通过EIA检测患者体内的IgA、IgG和IgM抗体，可以帮助判断是否存在HIV感染。
此外，EIA还能够检测到病毒特异性抗体，从而评估患者对病毒的免疫反应。
3. 免疫介导的溶血性贫血（Immune-mediated Hemolytic Anemia，简称IMHA）IMHA是一种免疫缺陷性疾病，其特点是机体产生了针对自身红细胞的免疫抗体，导致红细胞破坏增加。
EIA可以通过检测患者体内的抗红细胞自身抗体水平来辅助IMHA的诊断与治疗监测。
4. 免疫缺陷性疾病患者对疫苗的应答性评估免疫缺陷性疾病患者由于免疫系统功能受损，对疫苗的应答性可能下降。
EIA可以检测抗体水平，用于评估患者对于疫苗接种后的免疫应答情况，指导疫苗接种方案的制定。
EIA标准操作规程(sop)
酶联免疫吸附试验标准操作规程(SOP)目的：1、评价抗原/抗体的活性及最适包被比例的筛选。
2、抗原/抗体酶最适使用浓度的选择。
3、筛选最佳抗原/抗体。
4,抗原抗体的优化背景知识：ELISA是酶联免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
原理：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗原夹心法及ELISA间接法。
主体内容：【操作步骤】方法一用于检测抗体的双抗原夹心法:1.包被：用0.05M PH9.51碳酸盐包被缓冲液将抗原稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml(但可以借鉴上批对照的浓度和效价来选包被比例)。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100ul，4℃过夜（或37℃包被2个小时）。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗2次，每次1分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.封闭：用配好的夹心法的封闭液每孔120ul,37℃封闭0.5小时,拍干备用.3.加样：加稀释液和样品各50ul于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育0.5小时。
然后洗涤。
(一般做4份阳性血清和2份阴性血清.)4.加酶标抗原：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗原(经滴定后的稀释度)100ul(具体体积根据实验的设计要求来定)。
37℃孵育0.5小时，洗涤。
第9章酶免疫试验
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基）
与275nm（主酶） OD ELISA中应用最为广
值之比
泛的标记用酶
酶和酶作用底物
常用酶 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP
包被有待测细胞因子抗体的微孔板
基
+
分泌相应细胞因子的待测细胞
本
有或无刺激物培养
原 细胞因子被板上的特异性抗体捕获
理
后续的反应如同ELISA
一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜
色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关
酶联免疫斑点试验(ELISPOT)
第五节 发光酶免疫试验（LEIA）
原理：参与催化某一发光反应的酶来标记抗 体（或抗原），在抗原-抗体反应后加入发光 物，酶催化和分解底物发光，由光检测仪检 测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测 物的含量。
4°c过夜 封闭（牛血清白蛋白或小牛血清）
间接包被
亲和素-生物素化抗体（抗原） SPA-抗体（抗原）
间接吸附于固相载体上
三、酶结合物
1.辣根过氧化物酶（HRP） 2.碱性磷酸酶 （ALP) 3.β-半乳糖苷酶 (β-Gal)
四、酶的显色底物与酶促发光底物
常用底物 四甲基联苯胺 TMB
三大经典标记技术 放 荧酶 射 光免 免 免疫 疫 疫技 技 技术 术术
掌握：酶联免疫吸附试验； 熟悉：酶和酶作用底物、固相载体、酶
免疫测定的应用； 了解：酶标记抗体或抗原、酶免疫技术
的分类；
第一节 酶免疫试验的组成要素 第二节 酶免疫试验的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 酶联免疫斑点试验 第五节 发光酶免疫试验 第六节 酶免疫试验的临床应用及常用商品试剂的方法
酶免疫测定技术
IgM1 IgM2
Ag1
酶免疫测定技术的应用
均相法 ELISA法
均相酶免疫测定主要应用于小分子激素和半 抗原（如药物）的测定。 E M IT 方法快速灵敏、准确、专一, 适合临床 上常规检验。药物滥用、药物中毒(包括误 服与有意识服毒) , 吸毒酗酒、麻醉药成瘾， 安眠药成瘾较严重, 此外还有众多的精神病 患者, 因此各种类型的药物中毒是比较多的。 除了医疗工作需要进行治疗药物监测之外, 在急症及中毒治疗方面也要了解与掌握体 内药物或毒物的品种和浓度。本方法能够 适应上述的需要, 除用于血药浓度测定之外, 还有药物滥用与药物中毒的检测。
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梅毒的早期诊断：检测梅毒螺旋体IgM抗体（Tp－IgM）在早期梅毒诊断中有 重要的意义。采用ELISA法，进行血清/ 脑脊液的梅毒螺旋体IgM抗体的检测。 在献血员中梅毒螺旋体抗体的筛查中也常用此法，有利于控制和减少梅毒的 输血传播。 定量检测内毒素： 临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达 20％－30％，检测标本中的LPS 对早期诊断和防治有重要意义。 食品中有害成分残留的测定 检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶（HRP）标记高亲和力的黄曲霉毒素 Ｂ1 (AFTB1 )抗体，建立了直接竞争抑制ELISA 快速筛选法。大大缩短了检 测时间。 一些蛋白质即使经过了加工处理，也是一种潜在的过敏原，会让某些人产生 过敏反应。采用多克隆抗体间接竞争ELISA 法和抗体夹心ELISA 法，可测定 食品中的痕量花生蛋白和榛子蛋白。组胺既是鱼类食物中毒的主要原因，也 是“奶酪综合症”的病因。 测食品中的残留农药：迄今为止，应用ELISA检测食品中的残留农药主要是除 草剂、杀菌剂和杀虫剂。ELISA 法测定农药残留以其特异性强、灵敏度高及 快速准确而得到广泛的应用，尤其是现场控制水果、蔬菜、食品中的农药残 留，对发展无污染农产品，保障人体健康起到积极作用。 检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。 检测食品中其它成分：植物雌激素在植物中含量很低， 但它能帮助治疗一些 疾病。用ELISA 分析植物雌激素。牡蛎蛋白是牡蛎精粉的主要活性成分，可 采用斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)测定牡蛎蛋白的含量。另外，ELISA也 可以用来检测食品加工过程中的酶 (如磷酸丙糖异构酶、转谷氨酰胺酶 )含 量的变化。
酶免疫测定数值
酶免疫测定数值全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）是一种常用的生化实验技术，通过检测特定反应物与其对应抗体结合产生的酶活性变化来定量测定样品中目标分子的含量。
酶免疫测定广泛应用于医学诊断、生物学研究以及食品安全等领域，已成为一种重要的实验方法。
酶免疫测定的原理是利用酶标记抗体对特定抗原进行检测。
一般来说，酶标记抗体是经过特定处理，将受体稀释剂或胶体金等金属标记在抗体分子上。
在反应过程中，待检样品中的目标分子与抗体结合形成免疫复合物，然后将酶标记抗体加入反应体系中，再次结合形成复合物。
最后通过特定底物的化学反应使得酶生成的产物可定量检测，从而间接测定样品中目标分子的含量。
酶免疫测定技术具有灵敏度高、专一性强、操作简便、快速、重复性好等优点，被广泛用于检测生物体内各种代谢产物、重要生理指标以及各种疾病标志物。
比如：血糖、肝功、肾功能、心肌标志物、感染病原体等的检测。
在疾病的早期诊断、治疗及疗效监测中发挥着重要作用。
酶免疫测定技术的应用范围广泛，具有较强的发展潜力。
目前，美国、欧洲等发达国家已经建立了相对完善的酶免疫测定技术体系，不仅在临床医学领域得到广泛应用，还在食品安全、环境监测、药物检测等方面取得了丰硕的成果。
国内的酶免疫测定技术也在逐步完善和发展中，为我国的医学健康事业做出了积极的贡献。
值得一提的是，随着科技的不断进步和人们对健康的关注程度的提高，酶免疫测定技术也在不断发展和创新，出现了越来越多的新技术和新方法。
如基于原子力显微镜、扩增现象技术等的快速、高灵敏度检测技术，为酶免疫测定技术的发展带来了新的机遇和挑战。
相信随着技术的不断完善和应用的不断推广，酶免疫测定将会在医学领域和其他领域中发挥更加重要的作用。
酶免疫测定数值是通过对待检样品中目标分子的特定反应与酶标记抗体的结合来测定的。
该技术在医学诊断、生物学研究等领域得到了广泛应用，具有重要的意义。
临床免疫学检验-课件-第9章 酶免疫技术1
• 保有酶的催化活性和抗体（或抗原）的活性。 • 结合物有良好的稳定性。 • 标记方法简单、产率高、且重复性好。
制备酶结合物的方法
戊二醛交联法：以双功能交联剂为“桥”，分别 与酶和抗体（抗原）连接而形成结合物。
要求：交联剂至少含有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反应基团。
HRP催化TMB
HRP催化
– 终止反应； –提高显色的稳定性，退色慢！以TMB为例
不加终止液：2小时内反应产物退色，蓝色产物 在450nm有最大吸收峰，但峰值较低
加终止液：反应产物变成黄色，在450nm处具有 最大吸收峰，峰值比蓝色产物峰值高。
–不同显色体系里可能使用的终止液不同（酸或碱）。
– 定义：通过化学反应将酶与抗体或抗原形成结合物 – 作用：酶免疫测定技术的核心组成部分，它的稳定性
决定EIA试剂盒的有效使用日期。
（一）酶标记抗体或抗原的制备 （p50）
• 抗原和抗体的要求：
• 抗原：纯度高，抗原性完整; • 抗体：效价高、亲和力强、特异性强，能批量生产，易于分
离纯化。常用单克隆抗体
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）： β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）
辣根过氧化酶（HRP）
• HRP的性质: • 主酶（糖蛋白）+ 辅基（亚铁血红素）蔬菜作物辣根中含 量很高。 • 最高吸收峰:主酶(275nm)与酶活性无关；辅基(403nm)酶活 性基团
• HRP的纯度： • 纯度数(Reinheit zahl, RZ)表示：A403/A275 • 用于标记的HRP, RZ ≥ 3.0。 • 仅表示辅基在HRP中的含量，RZ越大不意味着酶活性越高， 酶变性后RZ不变但活性降低 。
免疫学检验中的酶免疫技术
免疫学检验中的酶免疫技术20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。
这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域。
目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。
其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新。
一、常用的酶及显色底物在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1。
表1 常用酶及底二、标记物的制备在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。
制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。
标记物制备的方法基本属于两类：（一）交联法交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）（二）直接法直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。
EIA法
酶免疫分析（Enzyme Immunoassay,EIA）是标记免疫分析中的一项重要技术,是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
作为经典的三大标记技术之一,酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新，不断和其他先进技术如荧光、发光技术以及仪器自动化相融合，日臻完善,许多自动化仪器实际上是EIA技术和其他现代化技术的复合体，其分析敏感度已达到甚至大大超过放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)的水平，因试剂稳定无放射性污染且分析形式日趋多样化，简易灵活，临床应用广泛而倍受重视。
1、酶免疫分析的技术进步近年来，EIA技术取得了显著的发展，主要表现在以下方面：1.1.继单克隆抗体后的第三代抗体基因工程抗体的应用，明显地提高了检测的特异性，基本消除了抗原、抗体间的非特异性交叉反应，保证了分析的准确性。
抗体制备技术的进步，使试剂的生产制备得以规模化，检测范围日益扩展，小分子抗原、半抗原的检测成为事实。
1.2.分析方式的改进与多样化提高了试验的敏感性。
1.2.1.除早期的竞争法，间接法外，又发展了双抗原夹心法测抗体，偶联酶标记法测抗原，桥联酶免疫分析，酶放大免疫分析技术等，后者应用了生物素-亲和素系统，底物循环放大系统，酶-抗酶放大系统及酶偶联放大系统等。
1.2.2.由于酶标记技术的进步，标记酶的应用已从过氧化物酶，扩展到碱性磷酸酶，β半乳糖苷酶，尿素酶，葡萄糖6磷酸脱氢酶，葡萄糖氧化酶，苹果酸脱氢酶，至今有二十多种酶被应用于EIA ，但应用最多的仍然是辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）和碱性磷酸酶（Alkalinephasphotase，ALP）。
1.2.3. 酶免疫分析与其它标记免疫分析相结合如与荧光免疫分析（Fluorescence Immunoassay ,FIA）结合形成荧光酶免疫分析（Fluorescence Enzyme Immunoassay ，FEIA），酶促放大时间分辨荧光免疫分析（Enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ，EATRFIA），EIA与化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）结合形成酶—化学发光免疫分析，增强化学发光酶免疫分析（ECLEIA）。
酶免疫分析仪
图
结果
测定结束后，保存测定结果，并用外置打印 机打印结果
关机
卸载样品盘，清洗管路后关闭仪器
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20
（二）仪器的维护
• 酶免疫分析仪是一种精密的光学仪器，良好的工 作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延 长其使用寿命。
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安装要求
①仪器放置在无强磁场和干扰电压且噪音低于40分贝 ②操作环境空气清洁，温、湿度适宜 ③避免阳光直射，以延缓光学部件的老化 ④操作时电压应保持稳定 ⑤保持工作台面干燥、干净、水平，有足够操作空间
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五、仪器的操作与维护与常见故障处理
开机
（一）
参数设置
操
接通接线板电源，打开酶标仪器开关，仪器 开始自检，自动预热2~3分钟。
打开酶联软件，进入主菜单，选择测量模式 以及某些参数作 流Fra bibliotek样品装载
将离心好的样品，放入样品盘，选择相应的 测定程序以及试剂盘。
程
样本测定
检查无误后，按”开始”键，酶标仪对样品 开始进行测试
2
酶免疫分析仪
• 酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）
❖目前临床免疫检验最常用 的分析技术，具有灵敏度 高，特异性强，试剂稳定 ，操作简单、快速且无放 射性污染等优点。
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一、酶免疫分析仪的分型
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（一）酶免疫分析技术的分类
• 根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶 标记物，可分为：
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（二）酶免疫分析仪的类型
• 根据固相支持物的不同而设计成的酶免疫分析仪可 以分为 微孔板固相酶免疫分析仪 管式固相酶免疫分析仪 微粒固相酶免疫分析仪 磁微粒固相酶免疫分析仪
临床检验免疫学酶免疫技术课件
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
酶免疫技术
1、酶标记抗体免疫组化技术类型： （1）直接法：■-Ag + Ab*E → ■-Ag-Ab*E
优点：简单、快速、特异 缺点：一种酶标抗体只能测一种抗原，敏感性较差
（2）间接法：■-Ag + Ab1 + Ab2*E → ■-Ag-Ab1-Ab2*E
优点：一种酶标抗体能测多种抗原，实用性敏感性 较直接法好 缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法
（一）斑点-酶联免疫吸附试验 （dot-ELISA ）
原理：似ELISA，但载体为硝酸纤维素 （NC）膜。更灵敏、节约、简便，易 保存 以检测抗体为例：
Ag
Ab1？
Ab2-E
底物
（二）斑点-酶免疫渗滤试验 Immunofiltration Assay，IFA
原理：以NC膜为载体，利用微孔滤膜 的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在 一特殊渗滤装置上以液体渗滤过膜的方 式迅速完成。以胶体金为标记物的金免 疫渗滤试验省却了酶对底物的反应，更 加简便快速。
（二）类
型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 dot-ELISA BAS-ELISA
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原，适用于多价大分 子抗原的检测，而不能用于测定半抗原 等小分子物质。
双抗体夹心法
间接法
此法是测定抗体最常用的方法。
酶免疫标记用于抗原检测
（一）基本原理
酶标记抗体或抗原： 抗体或抗原的免疫学反应特异性 ＋ 酶活性 酶是一种有机催化剂： 使底物基质水解而呈色 使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 ∴ 可用呈色反应显示酶的存在。 很少量的酶即可导致大量的催化过程， 所以极为敏感。
临床免疫学检验(名解及答题)
临床免疫学检验【名词解释】1、enzyme immunoassay（EIA）酶免疫分析技术，是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种免疫标记检测技术。
2、colloidal gold immunoassay胶体金免疫技术，是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。
3、immunoblot test（IBT）免疫印迹试验，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的技术。
4、precipitation reaction沉淀反应，指可溶性抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。
5、agglutination reaction凝集反应，指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
6、immunogen免疫原，指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
7、adjuvant （immunoadjuvant）佐剂（免疫佐剂），指预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质。
8、hapten半抗原，指仅有抗原性而无免疫原性的物质。
如多糖、多肽、类脂和核酸等物质。
9、monoclonal antibody（McAb）单克隆抗体，设法将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
10、Polyclonal antibody（PcAb）多克隆抗体，亦称免疫血清，用抗原以不同途径免疫动物，从动物血清中获取抗体，该类含有抗体的血清称为抗血清。
由于免疫动物的抗原往往具有多种抗原表位，可激活体内多个B细胞克隆产生针对抗原多种表位的混合抗体，因而抗血清也称为多克隆抗体。
11、tumor antigen肿瘤抗原，指细胞癌变过程中新出现的或异常表达的抗原物质。
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三、自动化酶标仪基本工作原理
光源 触摸屏电源 单 光路 微孔板
A/D转换
显示器 片 打印机
程控放大器
多路开关
光电检测
步进电机驱动
步进电机
送样机构
电源
机 电源
图2 工作原理方框图
四、ELISA操作步
（1）试剂的准备
（2）加样 （3）保温 使用恒温水箱 使用保温箱 （4）洗涤 （5）比色
五、ELISA质量控制
（一）的测试前标本的采集和保存
（1）可作标本广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分 泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可。 （2）标本采集时应尽量避免溶血，否则造成假阳性；长菌的 标本同样的道理易产生假阳性。 （3）抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性， 建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。 （4）标本保存：血清置4℃冰箱5天内完成测试；一周以上则 要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀。 （5）ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避 免，尤其不应与生化试验用同一管标本，最起码应先做免疫 后做生化 。
一、酶免疫测试（EIA）技术分类
酶免疫分析技术
非均相酶免疫分析
均相酶免疫分析
非均相液相酶免疫分析
非均相固相酶免疫分析
以聚苯乙烯制品作为载体的酶 联免疫吸附实验---ELISA
二、ELISA技术方法与原理
（1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性物质 形成"免疫吸附剂"；酶标记免疫活性物质，进 行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程； 灵敏度特异性相对较高。 （2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精密度 差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数 量级）。 （3）根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方 法：双抗体（原）夹心法 ；间接法；竞争法
十、RT-2100C型酶标仪基本操 作步骤
（1）开机，待机器自行检测稳定 （2）项目设置：RT-2100C所有项目均由用户 自行定义，最多允许设置100个项目。用户已 经设置的项目均在窗口中列表显示，关机时自 动保存。
（3）样品测试
（4）综合报告
实验操作项目：
血清睾酮的定量测定
酶免疫测试（EIA）技术
翁锡全
广州体育学院
酶免疫分析技术（enzyme immunoassay,EIA） 是继荧光免疫技术和放射免疫技术之后建立的一 种非放射性免疫技术，是将抗原抗体反应的高度 特异性和酶的高效催化作用相结合，发展建立的 一种非放射性标记的免疫性标记分析方法。酶免 疫分析系统则属于开放式的，符合标准的各种品 牌的ELISA试剂盒均可应用，且有灵敏度高、特异 性强、酶免疫试剂的性质比较稳定、操作方法简 便、快速、无放射性污染以及应用范围广等很多 优点。
（三）分析5）酶标仪判读结果
六、ELISA操作注意事项
（1）测试之前，冰箱内试剂一定要复温（至室温），并 检查是否已经变质，同时用双蒸水稀释浓缩的洗涤液和稀 释液，若用不合格的蒸馏水则可使空白值增高。 （2）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。 （3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （4）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。 （5）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
七、影响ELLSA测试结果常见问 题原因及解决方法
1.选择试剂 2.加样
3.孵育
4.洗板
5.显色
6.终止
7.读板
八、、RT-2100C型多功能酶标仪仪 器特点：
1、RT-2100C可广泛应用于传染病、肿瘤标志物、血液病、 艾滋病、内分泌障碍测定等临床论断领域。 2、大屏幕汉化界面，利用触摸屏和笔作为输入方式，极大 地方便了用户的操作输入。 3 、100个可编程的检验项目。 4、多种定量、定性计算方法 5、96孔可视化布板，空白位、对照位、样本位、标准品位 任意设置，同一板上可同时进行最多12个项目的测试。 6、8通道检测迅速准确(<5秒/板)，测试前的震动混匀功能。
九、RT-2100C型多功能酶标仪常用 测试项目
（1）肝炎类：甲肝抗体IgM、乙肝两对半、丙、丁、戊、庚性肝炎
抗体等 （2）传染病类：爱滋病、衣原体、肺炎支原体、腺病毒、幽门螺旋杆 菌、腮腺炎、麻疹、水痘、百日咳杆菌、流行性出血热、狂犬病等。 （3）肿瘤标志物类：卵巢癌、乳腺癌、胃肠道癌、癌胚抗原、甲胎蛋 白、膀胱癌、铁蛋白等。 （4）内分泌类：T3、T4、促卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、泌 乳 素 (PRL) 、 人 绒 毛 促 性 腺 激 素 (HCG) 、 睾 酮 (TESTO) 、 孕 酮 (PROG)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、生长素(HGH)、促甲状腺素 (TSH)、皮质醇或皮质酮(C)、促红细胞生成素(EPO)等。 （5）自身抗体类：ENA全套6项筛选、抗核抗体、抗Sm抗体、抗精子 抗体、抗双链/单链DNA、红斑狼疮筛选等。 （6）Torch类、病毒感染类：弓形虫、巨细胞病毒、风疹病毒、单纯 疱疹病毒等。 （7）细胞因子类：白细胞介素、可溶性CD抗原。
ELISA测试原理
1）将链霉亲合素包被的聚苯乙烯塑料试管安置固定。 2）将生物素标记的特异性抗体和待测抗原加入链霉亲 合素包被小管内，经温育，生物素和亲和素发生连接， 待测抗原和特异性抗体发生结合，形成固相包被亲合素生物素-特异性抗体-待测抗原复合物，然后进行洗涤， 除去未结合的抗原和生物素标记抗体。 3）加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的特异性抗体(酶标 抗体)，经温育形成固相包被链酶亲合素-生物素-特异性 抗体-待测抗原-酶标抗体复合物，再次进行洗涤，除去 多余的酶标抗体。 4）加入底物ABTS和H2O2，经温育，ABTS在辣根过氧 化物酶的作用下显色，然后经波长450nm的光度计测定 获得A值，从标准曲线上计算出待测抗原的含量。
7、大容量历史数据保存，最多可保存500个项目，1000个 病人，10000条样本记录。 8、形式多样的综合中文报告输出，支持多种品牌系列的外 置打印机。 9、强大的网络功能：可与医院内部计算机网络、质量监测 中心及雷杜用户服务中心联网，为工作带来极大的便捷。 10、配合使用雷杜酶标实验室管理系统，可以在联网计算 机上进行数据管理和分析。 11、辅助管理功能：内置科室数据库、医生数据库和系统 日志数据库。
（二）仪器质控
（1）移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直 接影响实验结果，利用称重法检查，一般应在±10%以内； （2）水浴箱：经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中 （或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差； （3）洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规 定一般不超过2ul，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管 孔是否堵塞； （4）酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变， 定期检测校正，使其保持良好的工作性能。