质粒抽提

获取高纯度质粒DNA DNA的方法 （3）获取高纯度质粒DNA的方法
密度梯度离心 CsCl密度梯度离心是最经典的方法，可获得高纯度 CsCl密度梯度离心是最经典的方法， 密度梯度离心是最经典的方法 质粒DNA 但繁琐费时。 DNA， 质粒DNA，但繁琐费时。 离子交换层析 DEAE离子交换层析利用DNA、RNA及蛋白质与DEAE基 离子交换层析利用DNA 及蛋白质与DEAE DEAE离子交换层析利用DNA、RNA及蛋白质与DEAE基 团间电荷作用的强弱差别分离 吸附层析法 玻璃珠吸附层析利用DNA DNA在高盐浓度条件下与细小 玻璃珠吸附层析利用DNA在高盐浓度条件下与细小 玻璃珠的特异性吸附作用进行分离。 玻璃珠的特异性吸附作用进行分离。
理论基础
细菌质粒是一类双链闭环的小分子DNA， 细菌质粒是一类双链闭环的小分子DNA，独立 DNA 于细菌染色体之外，能够进行自我复制。 于细菌染色体之外，能够进行自我复制。质 粒作为载体广泛应用于目的基因的克隆、 粒作为载体广泛应用于目的基因的克隆、测 表达等工作。 序、表达等工作。
宿主染色体DNA与质粒DNA主要区别： 宿主染色体DNA与质粒DNA主要区别： DNA与质粒DNA主要区别
7.将混合液加入放在套管的吸附柱CP3内 7.将混合液加入放在套管的吸附柱CP3内，离心 将混合液加入放在套管的吸附柱CP3 12000rpm×1min，弃流出液。 12000rpm×1min，弃流出液。 8.向吸附柱CP3加入漂洗液PW600μl， 8.向吸附柱CP3加入漂洗液PW600μl，离心 向吸附柱CP3加入漂洗液PW600μl 12000rpm×1min，弃流出液。 12000rpm×1min，弃流出液。 9.重复上一步。 9.重复上一步。 重复上一步 10.将吸附柱CP3放入套管，离心12000rpm×2min， 10.将吸附柱CP3放入套管，离心12000rpm×2min， 将吸附柱CP3放入套管 12000rpm 将残余的漂洗液去除。 将残余的漂洗液去除。 11.将吸附柱CP3置入1.5ml新离心管中， 11.将吸附柱CP3置入1.5ml新离心管中，向吸附膜 将吸附柱CP3置入1.5ml新离心管中 的中间部位滴加50 100μl洗脱缓冲液或去离子水 50洗脱缓冲液或去离子水， 的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液或去离子水， 室温静置2min 离心12000rpm 1min， 2min， 12000rpm× 室温静置2min，离心12000rpm×1min，收集流出 液。
电泳步骤
制备1 琼脂糖凝胶: 制备1％琼脂糖凝胶: TBE电泳缓冲液配制 琼脂糖溶液， 电泳缓冲液配制1 用 1×TBE电泳缓冲液配制1%琼脂糖溶液，微波炉中 加热至溶化（ min） 稍等微凉，加溴乙锭2 加热至溶化 （2min） 。稍等微凉 ，加溴乙锭2 ul， 混匀并灌制事先备好的凝胶板。 混匀并灌制事先备好的凝胶板。 点样： 点样： 取质粒DNA溶液5 DNA溶液 上样缓冲液1 混匀， 取质粒DNA溶液5μl、上样缓冲液1μl，混匀，上 样。 电泳 150V电泳30分钟 电泳30分钟， 150V电泳30分钟，至指示剂泳动至凝胶前缘时停止 电泳。 电泳。 紫外灯下观察结果。 紫外灯下观察结果。
实验一
质粒DNA的提取 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 DNA的提取、
实验目的
掌握质粒抽提的目的 了解质粒抽提原理 熟悉质粒抽提方法
一、实验原理
理论基础： 理论基础： 宿主染色体DNA与质粒DNA DNA与质粒DNA的区别 宿主染色体DNA与质粒DNA的区别 实验操作原理： 实验操作原理：三个基本步骤 细菌培养 裂解细菌以及质粒的初步分离 质粒DNA DNA的纯化 质粒DNA的纯化
37 C 振荡过夜
o
⑵ 裂解细菌以及质粒的初步分离
最普遍采用的方法是碱裂解法。 最普遍采用的方法是碱裂解法。将细菌培养 物离心并以缓冲液悬浮，加入SDS SDS溶液破坏细 物离心并以缓冲液悬浮，加入SDS溶液破坏细 SDS与加入钾离子沉淀大分子DNA并离 与加入钾离子沉淀大分子DNA 胞，再SDS与加入钾离子沉淀大分子DNA并离 心去除，小分子的质粒DNA即处于上清液中。 DNA即处于上清液中 心去除，小分子的质粒DNA即处于上清液中。
三、质粒抽提操作步骤
1.用接种棒取含有质粒的大肠杆菌接种于5ml含有 用接种棒取含有质粒的大肠杆菌接种于5ml含有 抗菌素的LB 培养液， 37℃ 振荡培养过夜（ 已备） LB培养液 抗菌素的 LB 培养液 ， 37℃ 振荡培养过夜 （ 已备 ） 。 2. 取 1.5ml 过 夜 培 养 物 ， 加 入 1.5ml 离 心 管 中 ， 12000rpm离心1min，弃上清液。 rpm离心 12000rpm离心1min，弃上清液。 加入250μl溶液PⅠ，旋涡混匀，静置5 min。 250μl溶液PⅠ 3.加入250μl溶液PⅠ，旋涡混匀，静置5 min。 加入新鲜配制的溶液PⅡ250μl PⅡ250μl并轻微颠倒混匀 4. 加入新鲜配制的溶液 PⅡ250μl并轻微颠倒混匀 6-8次 。 在进行混匀时不可振荡，以免基因组DNA断裂， DNA断裂 在进行混匀时不可振荡 ， 以免基因组 DNA断裂 ， 对质粒的纯化造成污染。 对质粒的纯化造成污染。 加入溶液PⅢ 250μl并轻微微颠倒混匀6 μl并轻微微颠倒混匀 5.加入溶液PⅢ 250μl并轻微微颠倒混匀6-8次。 离心12000rpm×10min 吸取上清液0 12000rpm min， ml， 6. 离心 12000rpm×10min ， 吸取上清液 0.6 ml ， 收 集于一个新离心管中。 集于一个新离心管中。
琼脂糖凝胶电泳检测
制备1 琼脂糖凝胶: 制备1％琼脂糖凝胶: 凝胶浓度决定孔径大小，应依据样品DNA分子长度调整。 DNA分子长度调整 凝胶浓度决定孔径大小，应依据样品DNA分子长度调整。 溴乙锭是DNA嵌合剂， DNA结合后经紫外光照射发出橙色 DNA嵌合剂 溴乙锭是DNA嵌合剂，与DNA结合后经紫外光照射发出橙色 荧光。 荧光。 DNA溶液上样 溶液上样。 DNA溶液上样。 DNA上样量以观察到清晰条带为宜 一般每个样品孔100ng 上样量以观察到清晰条带为宜。 DNA上样量以观察到清晰条带为宜。一般每个样品孔100ng 为宜。加样过多造成电泳条带形变、拖尾和扩散。 为宜。加样过多造成电泳条带形变、拖尾和扩散。加样量 越少分离效果越好，但溴乙锭的检出灵敏度有限， 越少分离效果越好，但溴乙锭的检出灵敏度有限，单一条 带的检测低限是2ng左右。 2ng左右 带的检测低限是2ng左右。 电泳。 电泳。 琼脂糖中，溴酚蓝的泳动速度相当于300bp左右DNA 300bp左右DNA片 在1％琼脂糖中，溴酚蓝的泳动速度相当于300bp左右DNA片 根据样品中DNA片段大小，注意指示剂泳动位置。 DNA片段大小 段。根据样品中DNA片段大小，注意指示剂泳动位置。 紫外灯下观察结果。 紫外灯下观察结果。 紫外灯有长波与短波两种类型。短波(254nm) (254nm)激发的荧光强 紫外灯有长波与短波两种类型。短波(254nm)激发的荧光强 度高， DNA损伤较大 长波(302nm)激发的荧光较低， 损伤较大。 (302nm)激发的荧光较低 度高，对DNA损伤较大。长波(302nm)激发的荧光较低，但 对DNA损伤较小。市售的紫外灯多数是长波型。 DNA损伤较小。市售的紫外灯多数是长波型。 损伤较小
纯化的质粒DNA有三种存在形式 纯化的质粒DNA有三种存在形式 DNA
共价闭环DNA，即超螺旋形式； 共价闭环DNA，即超螺旋形式； DNA 开 环 DNA, 即 质 粒 DNA 的 两 条 链 中 有 一 条 发 生一处或多处断裂， 生一处或多处断裂 ， 因此可以自由旋转从而 消除张力，形成松弛的环状分子； 消除张力，形成松弛的环状分子； 线状DNA 因质粒DNA DNA， DNA的两条链在同一处断裂 线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂 而造成。 而造成。
四、操作注意事项来自百度文库
加入溶液Ⅱ 加入溶液Ⅱ、Ⅲ时轻缓颠倒混匀，以免基因 时轻缓颠倒混匀， DNA断裂 造成质粒污染。 断裂， 组DNA断裂，造成质粒污染。 溴乙锭具有极强的致突变能力， 溴乙锭具有极强的致突变能力，使用时需谨 慎。 由于紫外线可造成视网膜严重损伤， 由于紫外线可造成视网膜严重损伤，因此不 可用肉眼直接观察紫外灯。 可用肉眼直接观察紫外灯。
质粒电泳示意图
Best better not good 点样孔
开环
双螺旋
线状
吸附层析法纯化质粒DNA 吸附层析法纯化质粒DNA
质粒的快速抽提 溶液I 含有RNA RNA酶 水解RNA 并为低渗溶液， RNA， 溶液 I 含有 RNA 酶 ， 水解 RNA ， 并为低渗溶液 ， 但由 于细菌有细胞壁，因此不会破裂。 于细菌有细胞壁，因此不会破裂。 溶液Ⅱ 中的SDS 具有强烈的破细胞作用， SDS具有强烈的破细胞作用 溶液 Ⅱ 中的 SDS 具有强烈的破细胞作用 ， 使基因组 DNA释放 DNA释放 溶液Ⅲ使基因组DNA SDS及钾离子结合形成沉淀 DNA与 及钾离子结合形成沉淀。 溶液Ⅲ使基因组DNA与SDS及钾离子结合形成沉淀。 将含有质粒的上清加入到层析柱中，利用玻璃珠吸 将含有质粒的上清加入到层析柱中， 附层析分离质粒。 附层析分离质粒。
宿主染色体DNA 宿主染色体 分子大小 抽提结果 分子大 断裂成为线状
质粒DNA 质粒 分子小 共价闭合环状结构
实验操作原理
分离质粒DNA包括3个基本步骤： 分离质粒DNA包括3个基本步骤： DNA包括
⑴ 培养细菌
在含有相应抗性的液体培养基中培养已转 染质粒的细菌， 染质粒的细菌，使细菌快速增殖的同时质 DNA得到大量扩增 得到大量扩增。 粒DNA得到大量扩增。目前常用的质粒均具 有很高的拷贝数。 有很高的拷贝数。