GST蛋白纯化

三．GST融合蛋白纯化

（1）GST亲和纯化

1．介质保存：20％乙醇

2．所需试剂：

①10×PBS（1L）：pH7.4 (4℃)

150mM NaCl（87.75g），16mMNa2HPO4(57.3g)，4mM NaH2PO4(6.24g)

②10×洗脱前buffer（100ml）：pH8.0 (25℃)

50mM Tris（6.1g），100mM NaCl(5.8g)

③洗脱buffer即凝血酶酶切buffer(500ml)：pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH变为8.0

50mM Tris（3.035g），100mM NaCl(2.925g)

洗脱前加1M CaCl2至终浓度2.5mM，加还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度20mM

也有文献使用谷胱甘肽终浓度为10mM，未对比过。

8ml介质结合的融合蛋白一般用30ml洗脱buffer（加75μl CaCl2和0.12g还原型谷胱甘肽）④3M NaCl

3．纯化步骤及注意事项：

①PBS平衡柱子：至少5个柱体积

②上样：经对比发现，上样流速需极慢才能结合，一般上样过夜（纯化原理是谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白对谷胱甘肽的亲和力）

③PBS洗杂蛋白：洗到紫外监测基线平，至少1小时，时间充分的话最好用较慢流速洗2到3小时，这样洗脱下来的目的蛋白中杂蛋白较少。

④洗脱前buffer换体系：至少2个柱体积，8ml介质一般用20ml

⑤洗脱buffer洗脱蛋白：洗脱速度很快，一般第2、3管浓度最大，注意收峰

⑥3M NaCl再生柱子：一般会洗出一个小盐峰，再生时间不可过长，否则对柱子有伤害，5个柱体积即可

（2）凝血酶酶切融合蛋白（以NGB为例）

先后使用过sigma和鼎国的凝血酶，sigma的酶效率更高。

鼎国凝血酶买来为干粉，3000U每管，溶于1ml凝血酶酶切buffer（补1M CaCl2至终浓度2.5mM），分装至每管10μl共100管，30U/管。

合并GST柱下来的目的蛋白，紫外分光光度计OD595测蛋白浓度。用鼎国凝血酶摸酶浓度：每35mg蛋白用凝血酶50μl，酶切约20小时。

对比25℃水浴酶切和摇床中酶切，定时取样检测酶切结果，发现摇床中酶切更快（可能是摇动过程中酶与蛋白能充分结合），但摇床中酶切产生的沉淀也更多。

GST琼脂糖凝胶FF

一、简介

GST琼脂糖凝胶是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和色谱填料，一步分离就可得到很纯的目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。

本产品是本公司自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，很好的物理和化学稳定性，使用寿命长，使用方便。良好的批次重复性，易于放大，所以无论是研发还是生产都是理想的选择。

二、亲和填料特性：

特点基团密度高，载量大

基质6%的交联琼脂糖凝胶

吸附载量5-10mgGST融合蛋白/ml

亲和填料的颗粒大小45-165μm

最大流速300cm/h

pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11

使用温度常温

保存温度+4~8℃

保存液体20%乙醇

化学稳定性70%乙醇，6 M盐酸胍

三、适用范围

分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。

四、应用实例

实验名称：GST琼脂糖凝胶分离GST融合蛋白

实验步骤：

1、 2.5cm，柱床体积为1ml； GST琼脂糖凝胶FF装柱，0.7

2、用缓冲液1平衡5个床体积，流速为1ml/min；

3、将10ml发酵液用缓冲液1稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；

4、用缓冲液1再洗10个床体积，流速为1ml/min；

5、用缓冲液2洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰

6、用纯水洗5个柱床体积，再用20%的乙醇洗5个柱床体积，流速为1ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存

缓冲液组成：

缓冲液1：20 mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2 M NaH2PO4 19ml，0.2 M Na2HPO4 81ml加水至1000ml。

缓冲液2：50mM Tris-盐酸缓冲液，pH8.0，配制：0.1M Tris 50ml，0.1 M 盐酸29.2ml，3070mg 还原型谷胱甘肽，加水至1000ml。

图1 GST琼脂糖凝胶FF分离GST融合蛋白

图2 纯化后SDS- PAGE

五、应用的注意事项：

1、GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量，很重要的一点就是保证足够作用时间，而流速是影响GST融合蛋白与色谱填料结合的关键因素之一，

所以必须在上样时维持较低的流速。

2、对不同的GST融合蛋白，洗脱体积和洗脱时间会有所不同，可能会需要更高浓度的还原型谷胱甘肽。如果需要的话，需要对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析。

3、GST融合蛋白的浓度也可以通过标准色谱法来确定。如果用Lowry 或者BCA分析，样品需要先利用HiTrap脱盐柱进行缓冲液交换处理或者是透析处理。以除去其中的还原型谷胱甘肽，因为还原型谷胱甘肽的存在会干扰测定。

5、GST琼脂糖凝胶能否重复利用要根据样品来定，而且只能用来处理同一种样品，以防止交叉污染。

六、GST融合蛋白的裂解

GST融合蛋白用凝血酶、肠激酶和Xa因子裂解，再用离子交换色谱把GST和目标蛋白分离。一般凝血酶用量为10U/mg，裂解条件是22-25℃，2-16小时。此外还可以亲和色谱把GST和凝血酶去除，而得到纯的目标蛋白。

七、再生、清洗、保存

1）在位清洗

１、除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2-3倍柱床体积2M 的NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗。

２、除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，用1M的NaOH以100cm/h的速度淋洗柱子1-2h，再反向淋洗。

３、所有操作中，都要用至少3倍柱床体积的初始缓冲液洗柱子。

４、除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4倍柱床体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇洗柱子，再反向淋洗。

八、保存

在20%乙醇，4℃下长期保存。