蛋白质分子量测定

（7）10%过硫酸铵（AP）：现用现配。 （8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取 Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定 容至1L。 （9）样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL， 甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液 0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配 制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。 （10）染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。 （11）脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL 甲醇混匀。
1.具有分子筛效应，分辨率高 2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g 3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具 有稳定的亲水基团 4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象 5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内 无色透明 6.网孔可调节
注意事项

1. 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测 定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出 的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异 常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖 蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组 蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结 合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正 电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶 电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用 两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。
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Kd=0
Kd=1 0<Kd<1 Kd>1
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质相对分子质量 Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE
实验原理
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯 酰胺凝胶电泳法，。 1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主 要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二 烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活 性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏 水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件 下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g 蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相 同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子 原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原 有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率 主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。
（二）光聚合：核黄素-TEMED系统
核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或 紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型， 但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离 基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意： 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用 光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影 响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的 分离。
3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，
电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合 下列方程： 1gMr =K―bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b 为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和 K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分 子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋 白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移 率即可在标准曲线上求得分子量。
<700
<1500
<5000
150020000
300070000
4000150000
5000300000
5000500000
Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝 胶
器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测 仪 、记录仪
仪器、原料和试剂



仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微 量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管； 常头滴管等。 原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg· ml-1 样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配 成混合蛋白质标准液。 试剂： （1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取 1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至 100mL。 （2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取 1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至 100mL。
试剂名称
配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂 用量/ml 5% 7.5% 5.00 10% 6.66 15% 10.00 3.33
配制10ml浓缩胶所需试 剂用量 3%
分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis)
-
分离胶缓冲液 （pH8.9Tris-HCl）
浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） 浓缩胶缓冲液 （pH6.7 Tris-HCl） 10% SDS 1%TEMED 重蒸馏水
pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
样品
样品胶
甘氨酸
浓缩胶 蛋白质 HCl
低 电 导 区
分离胶
3）pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度，从而控制其 有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH 值有所区别。
3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后，Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根 据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而 分离
C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。
C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
四、不 连 续 PAGE
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE
分 离 原 理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大 孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
蛋白质分子量测定的方法
凝胶过滤法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 沉降法（超速离心法）
凝胶过滤层析 应用
a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定
原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用
具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离。
由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特
分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30%
洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
装柱示意图
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核酸蛋白检测仪及记录仪（正பைடு நூலகம்）
核酸蛋白检测仪及记录仪（背面）
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核酸蛋白检测仪
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记录仪
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部分收集器
部分收集器
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2．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白
）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组 成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下， 解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一 类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们 的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整 分子的分子量。为了得到更全面的资料， 还必须用其它方法测定其分子量及分子中 肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互 相参照。
2.50
2.50
2.50
2.50
3.0 1.25 0.10 2.00 4.60
0.20 2.00 11.87
0.20 2.00 10.20
0.20 2.00 8.54
0.20 2.00 5.20
混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
10%AP
0.10
0.10
0.10
0.10
0.05
五、PAGE 的 特 点
习惯上把每分钟4,000转（
（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称 丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis） 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色 试剂瓶中，4℃保存。 （4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重 蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中， 4℃贮存。 （5）10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前微 热，使其完全溶解。 （6）1%TEMED；
内水体积Vi
外水体积Vo 柱床体积Vt 洗脱体积Ve Vt=Vo+Vi+Vg
Ve=Vo+KdVi
Kd=(Ve-Vo)/Vi
优点：
a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖
G-10 吸水量 （g/g干凝 胶） 工作范围 （肽与蛋 白）D 1.0 G-15 1.5 G-25 2.5 G-50 5.0 G-75 7.5 G-100 10.0 G-150 15.0 G-200 20.0
沉降法（超速离心法）
沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的
沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分 子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时， 由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降 速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方 法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为， 可判断出蛋白质的沉降速度。根据沉降速度 可求出沉降系数，将S带入公式，即可计算 出蛋白质的分子质量。
凝胶及柱的选择
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•凝胶的处理及装柱
凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡 装柱时要注意操作压。
装柱的两种方法： a.手工操作
1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢 加入凝胶
b.电动搅拌下的装柱法
（如图4-9）
样品上柱
定的蛋白质分子量范围，在此范围内， 分子量的对数和洗脱体积之间成线性关 系。因此，用几种已知分子量的蛋白质 为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质 的洗脱体积对它们的分子量的对数作图 ，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在 同样的条件下进行凝胶层析，根据其所 用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求 出此未知蛋白质对应的分子量。
一、PAG 的 组成
PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr） 单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’， N’-methylene bixacrylamide，Bis）交联剂 通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结 构。 Acr + Bis----- 多孔三维网状结构
（1）丙烯酰胺结构式
2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移 动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度 （）很小，有效迁移率（M ）很低，移 动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大， 移动速度快，称快离子。 蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介 于两者之间。
三、PAG的浓度与孔径的关系
PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单 体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的 大小，选择合适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性； ＜10 很脆，易碎，不透明； ＞100 糊状不成形，易破碎。
凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量 较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量 较大的物质。
（2）亚甲双丙烯酰胺
二、PAG 的 聚 合
需要催化剂——氧化还原系统作用，使 Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。
（一）化学聚合：AP-TEMED系统
过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二 胺（TEMED）为加速剂。
AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰 胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯 酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形 成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。 注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱 性条件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子 氧，隔绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟 聚合