实验法

实验法(二) 2.4-二硝基苯肼法

一、原理：

用酸处理过的活性炭把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸再继续氧化为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2.4-二硝基苯肼偶联天生红色的络合物。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。

二、试剂：

(1) 1％草酸溶液。

(2) 2％草酸溶液。

(3) 酸处理过的活性炭：取200克活性炭，加进10％盐酸1000ml，煮沸后，抽气过滤，再用沸水1000ml 煮沸，过滤，重复用水洗至滤液中无高价铁离子(即用1％硫氰化钾溶液试验不呈红色为止)，于100-120℃烘干。

(4) 2％2.4-二硝基苯肼溶液：取2克2.4-二硝基苯肼溶液溶解于lOOml9N硫酸中。

(5) 9N硫酸溶液：量取浓硫酸250ml，慢慢地倒进750m1水中，加水边搅拌。

(6) 10％硫酸溶液：称取5克硫酸，溶解于50ml50％酒精中。

(7) 85％硫酸溶液：精确称取20mg抗坏血酸，溶解在1％草酸中，溶液稀释至lOOml。吸取此液50ml，加进0.1克活性炭，振摇1分钟，过滤吸取上述滤液5ml，用1％草酸稀释到100毫升(此标准使用液每亳升含lOug抗坏血酸)。

三、操纵方法：

(1)样品的处理和分析：称取适量样品加等量的2％草酸溶液于组织捣碎机中打成匀浆。取匀浆20克用1％草酸稀释至lOOml，摇匀，过滤。

取滤液lOml，加进1％草酸10ml(取滤液的量视抗坏血酸含量而定，一般控制每毫升抗坏血酸的浓度为1-lOug)，加l勺活性炭，摇1分钟，静置过滤。

各取滤液2毫升于样品管和样品空缺管中，各管加1滴硫酸溶液。于样品管中加进2.4-二硝基苯肼

0.5ml，样品管，样品空缺管加盖，置于37℃保温箱中保温3小时。后取出样品管放人冰水中，样品管和样品空缺管置于冰浴中，从滴点管中滴加85％硫酸2ml于各管中，边滴边摇试管(为防止溶液温度升高，溶液中糖炭化而转玄色)。

将各管于冰浴中取出，在室温下放置30分钟后，立即在分光光度计波长540nm处读取光密度。根据测得的光密度，从标准曲线中查出相应的含量。

(2) 标准曲线的绘制：分别吸取抗坏血酸标准工作液10、20、30、40、50ml，稀释至50ml，这些标准液每毫升含有2、4、6、8、lOug抗坏血酸。

各取2ml，置于各标准管中，加硫酸溶液1滴和2．4-二硝基苯肼溶液0.5ml，置各管于30℃保温箱中保温3—4小时，取出，放在冰浴中，于各管中滴加85％硫酸2.5ml边滴边摇试管，然后取出，放置30分钟，于分光光度计540nm波长条件下测定光密度。根据测得的光密度绘制标准曲线。

同时作一试剂空缺，于一试剂空缺管中加进1％草酸溶液2m1，操纵同标准管。

计算：每百克食品中含抗坏血酸的毫克数＝C/W×100

C：相当于标准溶液的量(mg)

W：测定时所取得样品溶液相当于样品的量(g)

四、说明：

(1) 加进85％硫酸后，将试管从水中取出。溶液的颜色会继续变深所以必须计算好，加进硫酸后准于30分钟内比色。

(2)硫酸可防止抗坏血酸被氧化，且可帮助准于的形成，终极溶液中硫酸的浓度均需一致，否则影响色度。

维生素C又叫抗坏血酸(Ascorbicid)，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜中含量较多。是一种水溶性小分子生物活性物质，也是人体需要量最大的一种维生素。维生素C 具有还原性(其结构式如图1)，可以与许多氧化剂发生氧化还原反应，因此可以利用其还原性测定维生素C的含量。目前食品中测定维生素C含量的方法主要有碘量法，是利用维生素C的氧化还原性为基础的一种氧化还原方法。冈其酸度不易把握，碘需要标定且易挥发，而Vc不易稳定保存，使测定结果易出现偏差，且这种方法不适合微量分析；国标

GB/T6195-1986是采用2,6一二氯靛酚滴定法。利用样品溶液由蓝色转变为粉红色来辨别其滴定终点的到达。但是多数水果、蔬菜样品其提取液都具有一定的色泽而导致滴定终点不明显，使测定准确度降低。另外还有荧光光谱分析法 J、紫外一可见分光度法、色谱法、电化学法等，这些方法都存在着一定的局限性，如操作过程复杂，所用试剂不稳定，速度慢、背景¨干扰大。近年来，建立的测定Vc的其他方法还有催化动力学和光度法相结合的方法，及VC传感器测定方法，固定pH滴定法等。

该论文将对蔬菜、水果常用的维生素C含量的检测方法进行综述、比较。

图1 维生素C的结构式

1.2 以铜离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法

文献中报道了以铜离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法。该方法也是利用维生素C 在酸性介质中维生素C可将Cu2+定量的还原为Cu+，然后Cu+与SCN-反应生成CuSCN 沉淀，在高速离心机下有效地分离出CuSCN沉淀，洗涤后再经浓硝酸溶解，用原子吸收法测定沉淀中的含铜量，即可推知样品中维生素C的含量。具体测定方法如下：

分别吸取1mL配制的含一定量维生素C的标准溶液(随配随用)(分别含维生素C 50、100、200、300、400、500 µg)和样品提取液，依次放置于已编号的15mL离心管中，各加入

1mLCuSO4饱和溶液、1mL浓度为2％硫氰酸铵溶液、0.5mL盐酸-醋酸钠缓冲液和0.5 mL饱和NaCl溶液充分混和，稍后离心分离，弃去上层清液，小心地用少量水洗涤沉淀2～3次(注意每次用水不能超过1 mL)，加入0.5mL硝酸溶解后，转移至lO0mL的容量瓶中加水定容至刻度线，摇匀。分别用原子吸收分光光度计测定其含铜量，由所得的维生素C含量的标准曲线，可以得到相应样品的试验结果。

该方法所得的试验结果相对标准偏差RSD在5％以内加标回收率在96.56％～100.67％，其精密度和准确度均达到痕量分析要求。此方法的线性相关系数R=O 9989，表明相关性很好。

1实验方法 111 原理维生素 C 中含有烯二醇基团 ,具有还原性 ,在酸性介质中可将正二价铜定量地还原为正一价铜 ,并与硫氰酸根反应生成 CuSCN 沉淀 ,以离心分离、洗涤。用浓硝酸溶解后 , 原子吸收法测 Cu ,从而间接求出维生素 C 的含量。112 主要仪器及试剂美国 PE 原子吸收分光光度仪 ; 高速离心机 :5000 转/ min ; 组织粉碎机 ; 铜标准液 : 1mg/ mL ; 维生素 C 标准溶液 : 1mg/ mL ;浸提液 : 称取 20g 草酸 , 加 80mL 冰醋酸 , 溶解后转移到 1000mL 容量瓶中 , 用蒸馏水定容后摇匀备用 ; 硫酸氰铵溶液 ( 2 %) : 称取 4g 硫酸氰铵溶解后转移到 200mL 容量瓶中定容 ; 盐酸 - 醋酸钠缓冲液 ( PH1199 ) : 量取 50mL1mol/ L 盐酸 , 50mL1mol/ L 醋酸钠溶液 , 移到 250mL 容量瓶中定容至刻线 ; 饱和氯化钾溶液。 113 操作步骤11311 样品制备称取一定量的样品 ,用粉碎机粉碎 ,加浸液浸泡后抽滤 ,取滤液并用浸提液定容到一定体积。 11312 测定分别吸取一定量的维生素 C 标准溶液( 50 ,100 , μ 200 ,300 ,400 ,500 ,600 g) 和样品浸泡液于离心管中 ,分别加入

016mLCuSO4 标准溶液 ,016mL 硫氰酸铵 ,015mL 盐酸 - 醋酸钠缓冲液和 015mL 饱和氯化钾溶液 ,混合均匀 ,10min 后离心分离 ,弃去上层清液。用 5mL 水洗涤沉淀三