染色体显带技术和带型分析

实验三染色体显带技术和带型分析

一、实验目的

学习和掌握植物染色体Giemsa显带技术和带型分析方法，进一步鉴别植物染色体组和染色体结构。

二、实验原理

对植物有丝分裂中期染色体进行酶解，酸、碱、盐等处理，再经染色后，染色体可清楚地显示出很多条深浅、宽窄不同的染色带。各染色体上染色带的数目、部位、宽窄、深浅、相对稳定，为鉴别染色体的形态提供依据，也为细胞遗传学和染色体工程提供新的研究手段。

植物染色体显带技术包括荧光分带和Giemsa（吉姆萨）分带两大类。在植物染色体显带上最常用的是Giemsa分带技术，其中C带和N带较为常用。C带的形成认为是高度重复序列的DNA（异染色质）经酸碱变性和复性处理后，易于复性，而低重复序列和单一序列DNA（常染色质）不复性，经Giemsa染色后呈现深浅不同的染色反应。这种差异反映染色体结构的差异。

三、实验材料

洋葱、蚕豆、大麦、黄麻的根尖。

四、实验仪器及用具

多媒体系统（附显微演示），显微镜（附摄影装置），半异体致冷器，冰箱，恒温水浴锅，电子天平，液态氮装置，容量瓶，试剂瓶烧杯，染色缸，载玻片，盖玻片，剪刀，镊子，玻璃板，滤纸，标签，铅笔

五、药品和试剂

冰醋酸，无水酒精，甲醇，盐酸，柠檬酸钠，氢氧化钡，氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，甘油，Giemsa粉剂，果胶酶，纤维素酶

试剂1：Giemsa液：0.5克Giemsa，33ml甘油，33ml甲醇，用少量甘油将Giemsa粉末研磨至无颗粒，剩余甘油分次洗涤至棕色瓶内，置56℃恒温2h，加入甲醇，过滤后保存于棕色瓶中。

试剂2 ：5％氢氧化钡：5gBa(OH)2加入100ml沸蒸馏水中溶解后过滤，冷却至18－28℃。

试剂3：2×SSC溶液：0.3M氯化钠+0.3M柠檬酸钠。

试剂4：1M NaH2PO4溶液。

试剂5：1％纤维素酶和果胶酶混合液。

试剂6：1/15磷酸二氢钾和1/15磷酸氢二钠缓冲液。

六、实验步骤

（一）染色体分带

1. 材料准备待洋葱鳞茎发根长2cm左右，切取根尖进行预处理。蚕豆种子浸种发芽，待幼根长至3cm左右，切取根尖进行预处理。蚕豆主根根尖切去后继续长出的次生根，可再切取次生根根尖进行预处理。大麦种子发芽至幼根长1cm左右，切取白色的幼根进行预处理。

2. 预处理洋葱和蚕豆根尖在0.05％秋水仙碱溶液中预处理2~3h。处理温度一般为25℃。预处理后须用清水冲洗多次，洗去药液。

3. 固定以上各材料经预处理后，放入卡诺氏固定液中固定0.5~24h，转换到70％酒精，置于冰箱中保存备用。

4. 解离洋葱、蚕豆根尖在0.1N盐酸溶液中置于60℃恒温下处理10~15min。大麦根尖在37℃下用1％果胶酶处理30min，然后在0.1N盐酸溶液中置于60℃下处理5min。

上述材料用酸处理后，须用蒸馏水冲洗多次，除去残留酸液，否则将会影响染色体的显带效果。

5. 压片与常规的植物染色体压片方法相同。在45％醋酸中压片，制成白片。在相差显微镜下检查染色体分散程度，挑选出分裂相多，染色体分散均匀的片子。选出的玻片经液氮、CO2干冰或半导体致冷器冻结，用刀片揭开盖玻片。置室温下干燥。

6. 空气干燥脱水后的染色体标本一般需经过4~7天的空气干燥，再进行分带处理。不同的材料所需干燥的时间不一样。洋葱要求空气干燥的时间较严，未经空气干燥的染色体不显带，干燥一周后经显带处理显示末端带，干燥半个月后能同时显示末端带和着丝点带。而蚕豆、黑麦、大麦则要求干燥时间不十分严格。

7. 显带处理空气干燥后的染色体标本即可进行显带处理。处理方法不同，可显示不同的带型。

（1）C带HSG法（Hydrochloric acid~Saline~Giemsa method）将空气干燥后的洋葱、蚕豆染色体标本浸入0.2N盐酸（25℃左右）分别处理30和60min。用蒸馏水冲洗多次后，在60℃的2×SSC溶液中保温30min，再用蒸馏水冲洗数次，室温风干，即可染色。

BSG法（Barium~Saline~Giesa method）将空气干燥后的黑麦、大麦的染色体标本浸入盛有新配制的5％氢氧化钡饱和液的染色缸中，在室温条件下处理5~10min，然后用蒸馏水小心地多次冲洗浮垢后，在60℃的2×SSC溶液中保温60min，再用蒸馏水冲洗数次，室温风干，即可染色。

（2）N带将黑麦、大麦种子发根1cm左右切取，在0℃冰水中预处理24h。卡诺氏固定液中固定半小时以上，1％醋酸洋红染色液中染色2h，然后在45％醋酸中压片，冰冻法揭开。尔后在45％醋酸60℃条件下脱色10min，再在95％酒精室温下脱水10min，气干过夜。最后在1M NaH2PO4溶液中95℃恒温下保温2min，蒸馏水冲洗，气干后即可染色。

8. 吉姆萨染色吉姆萨母液用1/15M磷酸缓冲液按一定的比例稀释。例如，10份磷酸缓冲液加1份吉姆萨母液稀释即为10：1，一般都采用扣染法染色。在一干净的玻璃板上，对称放置两根牙签或火柴棒，距离与载玻片上的材料范围相等。将带有材料的玻片翻转向下，放在牙签上，然后沿载玻片一边向载玻片与玻璃板之间的空隙内缓缓滴入染色液，在室温下染色。染色时间因材料而异，因吉姆萨染料批号不同、质量上有差异，因此其染色液浓度和染色时间需作适当调整。下列材料的染色浓度和染色时间可供参考。

蚕豆pH7.2 10:1 30min

洋葱pH7.2 10:1 15min

大麦pH6.8 10:1 30min

黑麦pH6.8 20:1 30min

9. 镜检和封片染色后的玻片标本，用蒸馏水洗去多余染料，染色过深可用磷酸缓冲液脱色。室温下风干后即可镜检，挑选染色体带型清晰的片子，用树胶封片。

（二）染色体带型分析经过上述处理的植物染色体标本，可以显示出C带或N带的带型，一般有以下四种带型：

1. 着丝粒带（C带）带纹分布在着丝粒及其附近，大多数植物的染色体可显示C 带。蚕豆、黑麦、大麦等的染色体着丝粒带比较清楚，洋葱染色体的着丝粒带较浅。

2. 中间带（I带）带纹分布在着丝粒至末端之间，表现比较复杂，不是所有染色体都具有中间带。

3. 末端带（T带）带纹分布在染色体末端。洋葱和黑麦染色体具有典型的末端带，而蚕豆、大麦的末端带不明显。

4. 核仁缢痕带（N带）带纹分布在核仁组织者中心区。蚕豆的大M染色体和黑麦的第Ⅶ染色体具有这种带型。

同时具有以上四种带型的叫完全带，以“CITN”表示，其它称为不完全带，有“CIN”和“以CTN”型、“TN”型和“N”型。

根据植物各染色体上显示的不同带纹和带纹的宽窄，可按染色体组型分析的方法对同源染色体进行剪贴排列，绘出模式图，从而对各染色体的带型作出分析。

七、实验作业