植物组织中过氧化氢酶活性测定

植物组织中过氧化氢酶活性测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H

2O

2

发生累积。H

2

O

2

可以直接或间

接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解

体。过氧化氢酶可以清除H

2O

2

，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H

2

O

2

含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法

【原理】

H 2O

2

在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A

240

)

随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；

【试剂】

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/L H

2O

2

（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。

【方法】

1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。

表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表

25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H

2O

2

，每加完一管立即记时，并迅速倒入石

英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

3.结果计算：

以1min内A

240

减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=

式中A

240 = A

S0

－

A

S0

—加入煮死酶液的对照管吸光值；

A

S1

, A

S2

—样品管吸光值；

Vt—粗酶提取液总体积（ml）；

V

1

—测定用粗酶液体积（ml）；

FW—样品鲜重（g）；

0.1—A

240

每下降0.1为1个酶活单位（u）；

t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

【注意事项】

凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。【思考题】

1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?

2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?