3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法的建立
生鲜肉中3种食源性致病菌Taqman多重荧光定量PCR检测方法的建立
生鲜肉中3种食源性致病菌Taqman多重荧光定量PCR检测方法的建立陈秀琴1-2林甦1-2郑敏1-2黄梅清虫(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013)摘要为了建立一种可快速特异检测生鲜肉中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7的多重实时荧光定量PCR方法，试验针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和大肠杆菌O157:H7wzx基因的保守序列分别设计引物和Taqman 探针，建立多重qPCR反应体系，进行特异性、灵敏度和重复性研究，用该方法检测30份生鲜肉中的3种食源性致病菌，并与国标法进行比较遥结果表明：该方法只扩增3种靶细菌，对其它供试菌不扩增曰金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检测灵敏度均为105拷贝数/滋L，大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度为104拷贝数/滋L；该方法的重复性良好曰对30份生鲜肉进行检测，检出3份沙门氏菌、4份金黄色葡萄球菌和7份大肠杆菌O157:H7,与国标检测方法相比，大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌各有1份样品不符合，其它阳性样品完全一致遥说明建立的基于Taqman探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、快速地实现对生鲜肉中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7的检测遥关键词多重荧光PCR沙门氏菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌O157:H7检测食源性致病菌文献标识码:A文章编号：1003-4331(2021)03-0022-06Establishment of a multiplex Taqman real-time PCR assay for the simultaneous detectionof three foodborne pathogens in fresh meatChen Xiuqin1,2Lin Su1,2Zheng Min1,2Huang Meiqing1,2(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou350013;2.Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center,Fuzhou350013)Abstract In order to develop a rapid and specific multiplex real-time PCR assay for detection of Salmonella,Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7in fresh meat.The primers and Taqman probes were designed with invA,nuc and wzx gene as target sequence,corresponding Salmonella,Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7for the multiplex real-time PCR assay.The specificity,sensitivity and reproducibility of the assay were evaluated.Thirty fresh meat samples were screened for the3foodborne pathogens applying the assay compared with national standard.The results showed that the multiplex real-time PCR assay was able to detect the3target pathogenic bacteria,whereas other bacteria were not recognized.The sensitivity of the assay for Staphylococcus au-reus,Salmonella and Escherichia coli O157:H7was105copies/滋L,105copies/滋L and104copies/滋L,respectively.The repeatability of this assay was good.Among the30samples,3positive for Salmonella,4positive for Staphylococcus aureus,7positive for Escherichia coli O157:H7.All positive samples were consistent with the national standard method except for one Escherichia coli O157:H7positive sample and one Staphylococcus aureus positive sample.The results suggested that the Taqman probes-based multiplex real-time PCR assay is specific and rapid for detection of Salmonella,Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7in fresh meat.Key words Multiplex real-time PCR Salmonella Staphylococcus aureus Escherichia coli O157:H7Detection Foodborne pathogens食源性病原微生物严重威胁人民群众的生命安全。
三种食源性致病菌多重荧光PCR检测方法的建立
三种食源性致病菌多重荧光PCR检测方法的建立韩春来【期刊名称】《家禽科学》【年(卷),期】2011(000)008【摘要】In this paper,we designed the specific primers and probes targeting conventional genes from Salmonella,Listeria monocytogenes and Campylobacter jejuni.After optimization of reaction conditions,a multiplex real-time PCR was developed.Specificity of each simplex real-time PCR assay was validated by testing various bacteria including positive isolates and negative isolates.The sensitivity of the triplex PCR assay was determined by detecting serially diluted Purified DNA and DNA extracted from bacterial culture by boiling.The results indicated that it is effective,specific,sensitive technique which can be used as a effective tool for the rapid detection of three foodborne pathogens such as Salmonella,Listeria monocytogenes and Campylobacter jejuni.%根据沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的保守基因序列,设计特异性引物和以不同荧光素标记的探针。
三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测
三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测陈迪;杨银元;李凌飞【摘要】In order to establish a rapid, sensitive and specific PCR diagnostic method to detect the three foodbome pathogens including Esche-richia coli,Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes, their specific primers were designed. The specificity and sensitivity of primers were verified by single, duplex and triplex-PCR reaction, and by detecting the foods artificially infected with the three pathogens. The results showed that three foodbome pathogens were amplified purpose fragments, and no other non-specific fragments were amplified. PCR test for the foods artificially infected with the pathogens also received specific segments of the purpose bacteria, and the results were stable. The multiplex PCR method in the present study was highly specific and sensitive. It would provide a fast, simple, and reliable method for the rapid detection of foodbome pathogens, which had significant theoretical and practical meaning.%为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证.结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增.人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定.本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种快速、简便、可靠的方法,具有重要的理论意义及实践意义.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2011(024)006【总页数】4页(P2359-2362)【关键词】食源性致病菌;大肠杆菌;单增李斯特菌;沙门氏菌;多重PCR【作者】陈迪;杨银元;李凌飞【作者单位】云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明650201;云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明650201;云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明650201【正文语种】中文【中图分类】S646近年来，随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。
3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立
3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立摘要建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。
选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。
通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。
用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。
关键词食品;沙门氏菌;PCR快速检测方法;建立沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。
该菌广泛分布于自然界,目前全世界已经发现2 523个血清型,我国发现的血清型近300个。
许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素,以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见[1]。
常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位[2-3]。
有资料显示,我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4]。
另外,每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔,以及食品加工厂由于沙门氏菌污染,经常导致重大的经济损失。
因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性。
为有效地预防和控制疾病的发生,同时满足食品出口业日益发展的需要,建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。
随着分子细菌学研究的开展,人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测从表型特征鉴定逐渐向遗传特征的鉴定,而PCR技术是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点[5-7],因而从20世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。
PCR检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择,本研究选取invA基因作为靶序列设计1对引物,成功地建立了沙门氏菌的PCR快速检测方法。
多重PCR方法检测食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌
多重PCR方法检测食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌江迎鸿;谭贵良;陈亚波;李向丽【摘要】通过扩增霍乱弧菌(VC)、副溶血性弧菌(VP)和单核细胞增生李斯特氏菌(LM)的特异性核酸片段,建立了VC、VP和LM的多重PCR检测方法,相应的扩增片段分别为588、450、234 bp.该方法特异性强、灵敏度高、简便、快速,可实现对上述致病菌的同时检测,在接种食品中检测灵敏度达到103 CFU/mL.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)010【总页数】4页(P135-137,150)【关键词】多重PCR;霍乱弧菌;副溶血性弧菌;单核细胞增生李斯特氏菌;食品【作者】江迎鸿;谭贵良;陈亚波;李向丽【作者单位】中山市质量计量监督检测所,广东中山528403;中山市质量计量监督检测所,广东中山528403;中山市质量计量监督检测所,广东中山528403;中山火炬职业技术学院生物医药系,广东中山528436【正文语种】中文【中图分类】TS201.6长期以来，各食品质检部门和食品企业内部大都采用培养的方式对致病菌进行检测。
这些传统方法不仅费时、费力，而且结果假阳性较高，不能适应现代微生物快速检测发展的需要。
因此，近年来一些研究者开始采用新兴的分子生物学方法（如定量PCR和多重PCR法）对食品中致病菌进行检测。
其中多重PCR法是一种较为理想的方法，可在同一个PCR反应体系中加入两对或两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段，实现对多个致病菌的快速检测。
目前已有对水产品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌[1-2]以及对饮用水[3]和无公害畜禽肉中[1]多种致病菌进行多重PCR检测的报道，但未见对食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特氏菌3种致病菌进行多重PCR检测的研究。
本研究采用以上3种致病菌的特异性引物，在单重PCR的基础上建立了多重PCR检测方法，实现了多种致病菌的同步快速检测。
多重PCR检测四种食源性病原弧菌
多重PCR检测四种食源性病原弧菌食源性病原弧菌主要包括副溶血性弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌等。
这些细菌均具有较强的致病性，容易引起食物中毒等食品安全问题。
为了有效检测这些病原弧菌，多重PCR技术应运而生。
多重PCR检测技术是一种能够同时检测多个目标基因的PCR方法。
在这个过程中，不同的引物对应着不同的目标基因，通过特定的PCR扩增剂进行扩增。
在PCR反应过程中，如果存在目标基因，则会产生相应的扩增产物，从而被检测出来。
对于四种食源性病原弧菌的多重PCR检测，首先需要针对每种细菌设计特定的引物。
这些引物需要能够特异性与各自的目标基因序列进行结合，从而实现对目标基因的特异性扩增。
接下来，需要选择适合的PCR扩增剂，确保PCR反应的顺利进行，并产生足够的扩增产物。
在完成引物设计和PCR扩增剂选择后，就可以开始进行多重PCR实验操作。
需要将四种细菌的DNA样本进行混合，以实现对四种病原弧菌的同时检测。
随后，在PCR仪中进行多重PCR反应，通过调整不同的反应条件，如温度、时间等，以确保每种目标基因的特异性扩增。
通过凝胶电泳等手段对扩增产物进行检测，观察是否存在目标基因的特异性扩增条带。
多重PCR检测四种食源性病原弧菌具有较高的特异性和灵敏度，能够实现对这四种细菌的同时检测。
该方法还具有快速、简便等优点，可以在短时间内对大量样本进行检测。
在应用方面，多重PCR检测技术可以应用于食品检验、疾病诊断等领域，为食品安全和临床诊断提供有效的技术支持。
本文介绍了多重PCR检测四种食源性病原弧菌的方法。
该方法具有高特异性、高灵敏度和快速简便等优点，为食品安全和临床诊断等领域提供了有效的技术支持。
然而，尽管该方法具有许多优点，但仍存在一定的局限性，如可能受到实验条件、引物设计等因素的影响而出现假阳性或假阴性结果。
因此，在应用过程中需要结合其他检测方法进行综合判断。
未来研究方向应包括优化多重PCR反应条件、提高引物设计的准确性以及发掘更多新型的多重PCR技术，从而进一步提高检测的准确性和灵敏度。
多重PCR快速检测3种食源性致病菌
采用 Ｌ Ｂ培 养液 对 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、 产 单 核 李 斯 特 菌 和 沙 门菌 标 准 菌 株 进 行 增 菌 。根 据 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 ｎ ｕ ｃ基 因 、 产 单 核 李 斯 特 氏菌 的 ｈ ｌ ｙ Ａ基 因 、 沙 门 氏菌 的 ｉ ｎ ｖ Ａ基 因设 计 引 物 ， 通过多重聚合酶链反应ｆ Ｐ Ｃ Ｒ １ 对 上 述 ３种 食 源 性 致 病 菌 的 目的 基 因进行扩增 ， 同时 对 反 应 体 系进 行 优 化 。结 果 对 平 均 浓 度 为 ５ ｃ ｆ ｕ ／ ｍ ｌ 的金黄色葡萄球菌 、 产单 核 李 斯 特 菌 和 沙 门 氏菌 在 Ｌ Ｂ 培 养 液 中进 行 ８ ｈ振 荡 培 养 ， 可 以检 出 阳性 结 果 ； 把金黄色葡萄球菌 、 产单核李斯特菌 、 沙 门菌 、 志贺菌 、 蜡 样 芽孢 杆 菌 、 大 肠
吴建英， 宋建新 ， 曹金 萍， 涂智杰， 余慧宏， 胡芹， 魏建萍， 潘剑
ｆ 江 西 省 景 德 镇 市 疾 病 预 防控 制 中心 ， 江西 景德镇 ３ ３ ３ ０ ０ ０ １
摘 要 ： 目的 建 立 一 种 能 同 时检 测 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、 产单核李斯特菌和沙门菌 ３ 种 致 病 菌 的多 重 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 方 法 方 法
多重PCR 技术在快速检测食源性致病菌中的研究进展
目前，已有报道的食源性致病菌接近300种，其中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、单核细胞性李斯特菌等都是最常见的，由其引发的食源性疾病对人类健康造成了极大的危害，是食品安全重大隐患。
随着食品安全事故的频繁发生，人民对食品安全的关注程度越来越高。
食品微生物检验作为食品安全检测的一项重要的技术手段，可为保障食品安全提供强有力的科学依据。
当今社会飞速发展，传统微生物检验方法检验周期较长、培养鉴定繁琐复杂，已越来越难以满足现代社会食品安全快速检测的需要，因而更加快速简便高效的检测方法成为科研热点。
近年来，随着现代分子生物技术的快速发展，PCR技术被广泛应用于食源性致病菌检测领域。
1 PCR技术发展概况PCR即聚合酶链式反应，简单来说就是一种使DNA在短时间内呈指数增加的分子技术。
PCR是通过控制不同温度实现DNA变性-退火-延伸这一过程的连续多次循环，每循环一次（约2～4 min）DNA扩增一次，3 h 就可以将特定DNA倍增成百上千万倍。
经过30多年的发展，PCR技术已有十几种之多，例如QPCR、多重PCR、微滴式数字PCR、反转录PCR等，目前被广泛应用于农业、医药、食品、考古等领域。
在食品安全检测领域，PCR技术主要应用于微生物、转基因食品的检测、动物源性成分检测等方面。
2 多重PCR技术多重PCR的基本原理、反应试剂和操作过程与常规PCR相同，不同之处在于可以在同一PCR反应体系中同时加入多种特异性引物从而实现多种目的DNA的同时扩增，在保留传统PCR检测质量优势的同时显著减少检测步骤，具有高效性、系统性、经济简便性等特点，目前在食品中多种微生物的同时检测中得到广泛应用。
3 研究应用进展3.1 在果蔬检测中的应用大连理工大学博士冯可[1]根据鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和单核增生性李斯特菌4种致病菌菌的靶基因设计特异性探针,建立了同时检测鲜切果蔬中这4种致病菌的多重实时荧光PCR检测方法，对应的检出限分别为4.2×104、1.8×104、7.3×104C F U/m L和5.4×104 CFU/mL。
PRV、PCV2与PPV三重PCR检测方法的建立与初步应用
ｂｐ（ＰＲＶ），２５５ ｂｐ（ＰＣＶ２）ａｎｄ ７５９ ｂｐ（ＰＰＶ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ
Hale Waihona Puke ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｅｒｅ ２．５ｘ１０～ｎｇ，２．２ｘ１０～ｎｇ ａｎｄ ３．７ｘｌＯ～ｎｇ，ｒｅ— ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｉｆｔｙ－ｓｉｘ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
瑚
㈣
２５５ １９２
Ｍ．２０００ＤＮＡ Ｍ盯ｋｅｒ；１．ＰＲｖ，Ｐｃｖ２，ＰＰｖ；２．ＰＲｖ；
图３
ＰＲＶ，ＰＣＶ２，ＰＰＶ－－ｉＰｃＲ特异性
３．ＰＣＶ２；４．ＰＰＶ；５．阴性对照
Ｍ ２ ３ ４ ５
图２
ＰＲＶ、ＰＣＶ２、ＰＰＶ
ＰＣＲ扩增
２．２
ＰＣＲ产物的鉴定
将ＰＣＲ产物连接ｐＭＤｌ９一Ｔ载体后，转化Ｔｏｐｌ０ 感受态细胞，送上海英骏生物技术有限公司测序。结
ＨＡＯ Ｆｅｉｌ，ＬＩＵ Ｊｉａｎｌ，Ｌｉ Ｄａｌ，ＷＥＩ Ｇｕａｎｄｏｎ９１
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ；
２．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ
Ｌｉａｎｇｓｈｕｉｊｉｎｇ
收稿日期：２０１４—０４—２９；修回日期：２０１４－１０－２９ 基金项目：贵州大学研究生创新基金（研农２０１４０１３）；贵州省科 学技术基金（黔科合Ｊ字［２０１３］２ｌｌｏ号）；贵州省２０１４年农业攻关 项目［黔科合ＮＹ字（２０１４）３０５５号］ 作者简介：王洪光（１９８９一），女，硕士生 ＋通信作者：汤德元，教授，博士，硕导，主要从事动物传染病 病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｄｙｕａｎ
食源性致病菌多重PCR和基因芯片检测方法的建立
上海交通大学硕士学位论文食源性致病菌多重PCR和基因芯片检测方法的建立姓名：陆长勇申请学位级别：硕士专业：食品科学指导教师：史贤明20090201食源性致病菌多重PCR和基因芯片检测方法的建立摘要食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素。
常见的食源性致病菌主要包括金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌。
本研究利用基因组比对方法挖掘单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7基因组中的特异性序列，建立了相关检测靶点库，设计和筛选特异性引物。
同时整合其它已挖掘和报道的检测靶点和引物，利用筛选和整合的引物建立多重PCR体系和基因芯片方法，检测上述八种食源性致病菌。
主要研究结果如下：1、多重PCR检测体系。
利用引物nuc-j，Vp2，prs，C20，SG，ial，hly-A和hipO1，建立了八种食源性致病菌多重PCR检测体系，经优化后确定退火温度Tm值和Mg2+浓度分别为56ºC和1.5 mmol/l，多重基因组DNA检测灵敏度可达到10 pg。
2、基于单碱基延伸标签反应的玻片芯片方法。
通过多重PCR和玻片芯片技术联用，设计SBE-tags引物进行荧光标记反应，建立八种食源性致病菌的玻片芯片检测方法。
该芯片方法的多重基因组DNA检测灵敏度和细菌纯培养物检测灵敏度分别为0.1 pg和5.0×102 cfu/ml，分离iv菌株检测结果与国标方法的符合率达到100%。
3、管式流动芯片检测方法。
应用管式流动芯片系统检测八种食源性致病菌，检测高效特异，细菌纯培养物检测灵敏度可达到 6.2×102 cfu/ml。
相比较基于单碱基延伸标签反应的玻片芯片方法，管式流动芯片检测时间短1.5 h，自动化程度高。
关键字：食源性致病菌，多重PCR，基因芯片，单碱基延伸标签，管式流动芯片vDEVELOPMENT OF MULTIPLEX PCR AND GENE CHIP MEHTODS FOR THE DETECTION OF FOODBORNPATHOGENSABSTRACTFoodborn pathogens including Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Enterobacter sakazaki, Shigella spp., Escherichia coli O157:H7 and Campylobacter Jejuni are primary factors threatening food safety and human health. Specific target sequences of Listeria monocytogenes, Enterobacter sakazaki and Escherichia coli O157:H7 were achieved by mining with a genome comparison and evaluation with PCR method. Other identified and reported target sequences and primers for the detection were selected and validated. Then multiplex PCR and gene chip methods were developed and optimized for the detection of the eight foodborn pathogens.In this study, the multiplex PCR was established with primers including nuc-j, Vp2, prs, C20, SG, ial, hly-A and hipO1, and accomplished at an optimal Mg2+ concentration of 1.5 mmol/l and an annealing temperature of 56ºC. The sensitivity of multiplex PCR method was approximately 10 pg of genomic DNA per reaction. Based on the multiplex PCR, the single base extension-tags microarray was developed with designed SBE-tags primers.viThe sensitivity of microarray method was 0.1 pg of genomic DNA and 5×102 cfu/ml for cultures per reaction. Comparing to GB method, the coincidence rate for the detection of separated strains was 100%. In addition, the bead-based mesofluidic chip was applied to detect eight general foodborn pathogens with a sensitivity of 6.2×102 cfu/ml for cultures. The detection time of bead-based mesofluidic chip with a higher degree of automation was 1.5 h less than the single base extension-tags microarray.KEYWORDS: foodborn pathogen, multiplex PCR, gene chip, SBE-tags, bead-based mesofluidic chipvii英文缩写表Abbreviations英文缩写词英文全名中文全名BLAST Basic local alignment search tool 序列相似性分析工具CFU Colony forming unit 菌落形成单位十六烷基三甲基溴化铵bromideCTAB Cetyltrimethylammoniumacid 脱氧核糖核苷酸DNA Deoxyribonucleictrisphosphate 脱氧核苷三磷酸（四种）dNTP Deoxyribonucleicbromide 溴化乙锭EB EthidiumEDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸medium LB培养基LB Luria-BertaniPBS Phosphate buffered solution 磷酸缓冲液PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应acid 核糖核酸RNA Ribonucleicrpm Revolutions per minute 每分钟转数SBE Single base extension 单碱基延伸SDS Sodium dodecyl sulphate 十二烷基磺酸钠SNP Single nucleotide polymorphisms 单核苷酸多态性TE Tris EDTA buffer Tris EDTA缓冲液Tm Meltingtemperature 熔解温度xi上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。
浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立
浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立张亮;刘磊;豆艳丽;张宇;郭玉蓉【摘要】根据大肠杆菌的β葡糖醛酸酶基因(uid)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc),分别设计3对特异性引物,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性以及扩增条件进行优化.结果表明:3对引物分别能扩增出147 bp、570 bp和280 bp的特异性条带,反应条件优化后,3种目的菌在104 CFU/mL时均可同时扩增出较清晰条带(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在103 CFU/ml浓度下仍然可见到条带),仅沙门氏菌的检测比单基因PCR低一个稀释度,人工模拟果汁污染试验结果稳定.该方法操作简单、快速、特异性强,灵敏度高,能够实现对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种菌的快速诊断检测和生产过程监控.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2012(047)003【总页数】6页(P124-128,133)【关键词】浓缩苹果汁;大肠杆菌;沙门氏菌;金黄色葡萄球菌;多重PCR【作者】张亮;刘磊;豆艳丽;张宇;郭玉蓉【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730000;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730000;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730000;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730000;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710062【正文语种】中文【中图分类】TS275.5大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是影响食品卫生安全及引起食物中毒的病原菌，也是浓缩果汁生产过程中必需检测的污染菌.采用常规方法检测这些污染菌需要分离培养和生化试验等多个步骤，检测耗时长、灵敏度低、操作复杂，需要专业人员严格操作，且每次只能做单一污染菌的检测，无法满足生产和检疫的要求.因此，迫切需要建立评价浓缩果汁被污染的主要指标的大肠杆菌以及引起细菌性食物中毒的主要致病菌的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速、灵敏和特异性强的检测方法.近年来，随着分子生物学检测技术的发展，在常规PCR［1－3］基础上发展起来的多重PCR检测技术，实现了一次性检测多种污染菌的新技术，该技术具有成本低、速度快、操作简便等优点，已在多种食源性及兽医微生物的检测中得到应用［4－17］，有良好的发展前景.在国内，李博等［18］根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、志贺菌的ipaH基因、沙门氏菌的invA基因设计引物，建立了能快速同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门氏菌的多重PCR检测方法；陈伟等［19］根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、单核细胞增生李斯特氏杆菌的hly基因和蜡样芽孢杆菌的hemolysin基因设计引物，建立了能快速同时检测食品中金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏杆菌和蜡样芽孢杆菌的多重PCR检测方法；王慧等［20］根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因和单核细胞增生李斯特氏杆菌编码溶血素O的hlyA基因设计引物，建立了能快速同时检测食品中奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌的多重PCR方法；钱玉春［21］根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、副溶血性弧菌tlh基因分别设计引物，建立了能灵敏快速且特异地检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的多重PCR体系；孙鸿燕等［22］根据志贺氏菌ipaH基因、李斯特菌hlyA基因、大肠杆菌O157的H7hlyA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因设计引物，建立了能快速且特异地检测志贺氏菌、李斯特菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR.但目前，关于大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌这3种果汁中常见污染菌的多重PCR检测还未见相关报道.鉴于此，本研究建立了能同时针对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的三重PCR检测方法，以期为实现准确、快速的监测工厂生产过程中和果汁成品中的污染菌，进而保障浓缩苹果汁产品的卫生安全提供理论依据.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株本试验所用菌株金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、肠炎沙门氏菌（ATCC13076）、大肠杆菌（ATCC25922）均购自美国模式培养物集存库（ATCC）；其他菌株如棒状杆菌、脂环酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特氏杆菌、志贺氏杆菌、绿脓杆菌、鼠疫耶尔森氏菌和多杀性巴氏杆菌等均购自中国兽医药品监察所.1.1.2 主要试剂rTaq、MgCl2、dNTP、10×PCR Buffer均购自北京全式金公司；DNA Marker、PMD18－T Vector、双酶切酶等均购自大连宝生物工程公司；胶回收试剂盒购自Axygen.1.2 方法1.2.1 细菌的培养和模板的制备分别挑取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌3株模式菌株的单菌落分别接种于营养肉汤、LB培养基和亚硒酸盐增菌培养基中，37℃振荡过夜培养，对菌株进行平板计数，分别配制浓度为108 CFU/mL的3种菌液.细菌模板采用宝生物miniBEST菌体基因组DNA提取试剂盒Ver.2.0制备，操作步骤参照试剂盒内说明书进行.1.2.2 扩增目的基因及引物设计以大肠杆菌的uid基因、沙门氏菌的invA基因和金黄色葡萄球菌的nuc基因片段［23］为研究对象，根据GenBank中提交的基因序列，参照已发表的针对3种菌的单PCR检测引物，应用多重PCR特异性引物设计系统（MPprimer）［24］和 Primer 5.0引物设计软件，设计和修饰得到3对特异性引物（表2）.引物均由大连宝生物工程公司合成.1.2.3 单一PCR扩增及特异性和敏感性分析先对3种菌株进行单独扩增，反应体系为20μL：10×Taq酶buffer（不含 Mg2＋）2.0μL、MgCl21.2μL（25mmol/L）、上下游物各1dμL（25mmol/L）、NTP 1μL（2mol/L）、模板DNA 2μL、Taq 酶0.5μL（2U/μL），其余用去离子水补足.PCR扩增条件：94℃预变性3min；每个循环条件为94℃变性28s，56℃退火28s，72℃延伸35s，32个循环；产物末端72℃延伸8min.PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶中，90V电泳35min后，观察产物条带.表1 目的基因名称及引物序列Tab.1 Purpose gene sequences and primers sequence菌种名称 NCBI注册号目的基因引物序列扩增长度/bp大肠杆菌AY447108 uid基因上游引物：AAAACGGCAAGAAAAAGCAG下游引物：ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG 147沙门氏菌 CP001363 invA基因上游引物：TACTTAACAGTGCTCGTTTAC下游引物：ATAAACTTCATCGCACCGTCA 570金黄色葡萄球菌 CP003166 nuc基因上游引物：ACGGGTAGGCATCTACTTGT 下游引物：AGGAGCTTTCCACTCTCCTTGT 280目的条带胶回收后，连入Ti质粒并转化大肠杆菌，将阳性克隆送往大连宝生物工程公司进行测序鉴定，并与GenBank中发表的相应序列进行比较.分别将配制好的108 CFU/mL 3种细菌菌液，无菌操作按10倍递增稀释至浓度为102CFU/mL，同样采用宝生物miniBEST菌体基因组DNA提取试剂盒Ver2.0分别提取DNA，进行PCR检测，能检出的最低细菌浓度为该体系的灵敏度.1.2.4 单管多重PCR反应体系的优化10×Taq酶buffer（不含 Mg2＋）2.0μL、MgCl1.2μL（252 mmol/L）、dNTP 2μL（2mol/L）、引物6μL（每条引物各1μL，浓度25mmol/L）、模板DNA 6μL（3种菌各2μL）、Taq酶1μL（2U/μL），其余用去离子水补足，总体积20μL，扩增条件同上.根据多次试验和经验，调整影响较大的引物浓度、模板量和Tm值，然后初步确定一定的范围，控制单一变量设计L16（43）正交试验，结合尽量缩短检测时间的原则，最终确定最佳反应体系. 1.2.5 多重PCR特异性和敏感性测定1.2.5.1 PCR特异性为进一步验证本试验设计的多重PCR的特异性，分别以3种模式菌株提取的单一DNA为模板，同时加入3对引物进行扩增；此外，选取其他菌株，随机组合，同时加入3对引物进行扩增.1.2.5.2 PCR敏感性将配制好的108 CFU/mL 3种细菌菌液，无菌操作按10倍递增稀释，使菌液浓度为108～101 CFU/mL.取各相同浓度菌液1mL混合，提取DNA，按已优化的多重PCR反应条件分别进行扩增，测定多重PCR的灵敏性.1.2.6 人工模拟样品的检测和果汁样品的验证采用人工模拟污染经检测3种菌为阴性的果汁样品，将3种菌的菌悬液10倍递增稀释至含菌量在101～103 CFU/mL 后，任意1种、2种和3种待检菌与果汁混合，人工染菌的果汁样品以1∶10加入相应的增菌液中，过夜培养后，提取DNA，进行PCR检测，同时对培养液进行培养计数.从生产过程不同阶段和来源采集到的苹果汁以及长期放置的苹果汁共30份作为样品进行检验.无菌操作取样品1mL均质，加入到9mL增菌培养基中，37℃振荡过夜培养，提取DNA，进行多重PCR检测，同时用常规方法和单一PCR检测，以验证建立的多重PCR检测方法的可行性与准确性.2 结果与分析2.1 单一PCR扩增和核苷酸序列分析金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的模板DNA在加入各自的引物扩增时，分别得到预计的PCR产物片段，即280bp、570bp和147bp.经克隆测序发现，大肠杆菌与GenBank中AY447108 uid基因相应序列同源性为100.0%，沙门氏菌扩增片段与GenBank中CP001363 invA基因相应序列同源性为100.0%，金黄色葡萄球菌扩增片段与Gen－Bank中CP003166 nuc基因对应序列的同源性为100.0%.2.2 单一PCR敏感性分析PCR检测金黄色葡萄球菌的灵敏度达到了103 CFU/mL（图1A），大肠杆菌的灵敏度达到了103 CFU/mL（图1B），沙门氏菌的灵敏度达到了104 CFU/mL（图1C）.图1 3种细菌单一PCR方法敏感性检测结果Fig.1 The sensitivity results of single PCR of three kinds of bacteria图A中，1：DNAmaker，2～6泳道依次为102～106 CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌菌液的单PCR产物；图B中，6：DNAmaker，1～5泳道为102～106 CFU/mL浓度的大肠杆菌菌液的单PCR产物；图C中，1：DNAmarker，2～6泳道依次为102～106 CFU/mL浓度的沙门氏菌菌液的单PCR产物；A、B、C图中，DNAmarker均为100bp DNA ladder，从下往上，依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、2 000bp.2.3 单管多重PCR的扩增及其条件的优化初步条件下，在同一试管中未同时扩增出3种目的基因片段，只能扩增2条目的片段，另外一条目的片段模糊，经试验优化后，1%琼脂糖凝胶电泳显示在147、570和280bp处有3条明显的目的条带.优化后的反应体系为：模板DNA 3μL（大肠杆菌1μL、沙门氏菌1μL、金黄色葡萄球菌1μL）、上下游引物7μL（大肠杆菌各1μL、沙门氏菌各1μL、金黄色葡萄球菌各1.5μL）、dNTP 2.5μL（2.5mmol/L）、Taq酶1μL（2U/μL）、10×Taq酶buffer（含 Mg2＋）2.0μL，其余用去离子水补足，总体积20μL.PCR扩增条件同单一PCR.2.4 多重PCR特异性和敏感性测定结果3种目的菌均出现特异性条带，其他非目的菌均未出现特异性条带（图2A）.由图2B可知，在107～105 CFU/mL下，3种菌均可同时扩增出较清晰条带（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在104CFU/mL下仍然可见到条带），比单重PCR低1个稀释度.图2 三重PCR检测方法灵敏性检测结果Fig.2 The sensitivity result of triplex PCR图A中：3泳道为500bp DNAmarker，从上到下依次为500、400、300、200、150、100和50bp，4泳道为2 000bp DNAmarker，从上到下依次为2 000、1 000、750、500、250和100bp，1：肠炎沙门氏菌，2：金黄色葡萄球菌，5：大肠杆菌，6：棒状杆菌、志贺氏杆菌，7：鼠疫耶尔森氏菌、多杀性巴氏杆菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌，8：枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和脂环酸芽孢杆菌，9：肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌和普通变形杆菌，10：空白对照；图B中，1泳道为100 bp DNA ladder，从下至上依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000bp和2 000bp，2：空白对照，3～7泳道：103～107 CFU/mL浓度的3种菌混合菌液的三重PCR结果.2.5 人工模拟试验结果人工染菌苹果汁中，染菌量在每mL样品中大肠杆菌含量50CFU，沙门氏菌含量40CFU，金黄色葡萄球菌含量48CFU.经增菌培养后，含菌量都能达到107～108 CFU/mL.运用优化后的多重PCR反应体系，能够扩增出相应的特异性条带.试验证明，3种污染菌随机组合后人工污染的样品能够同时检测出所接种的致病菌，且无非特异性扩增，说明该多重PCR检测方法对食品中存在的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有很好的特异性和敏感性.生产样品检测中，通过建立的多重PCR 方法从30份样品中检测到有6份样品含有目标菌，其中3份为沙门氏菌污染，1份为大肠杆菌污染，2份为沙门氏菌和大肠杆菌混合污染，未发现金黄色葡萄球菌污染，与单一PCR和常规方法检测结果一致，3种方法的符合率达100%.表明该多重PCR检测结果准确可靠，尚未出现漏检现象.3 讨论与结论本研究在参考前人研究的基础上［25－27］，尝试用多重PCR检测大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌.当前用于病原检测的PCR技术由于受到不能区分病原菌是否存在而在临床应用中受到限制，而本试验对样本先进行增菌，再取增菌液进行检测，检测的是活的菌体.虽然较直接从样品中提取基因组进行检测多耗费时间，但增菌过程大大提高了检测的敏感性，且去除了果汁中其他成分对DNA提取的影响.影响多重PCR的因素复杂，模板和引物浓度及其比例、检测引物之间、dNTP浓度、退火温度、Mg2＋浓度等都会对PCR结果造成不同程度的影响.在本研究过程中发现，对扩增结果影响较大的是模板浓度、引物浓度和Tm值，这与其他多重PCR方法建立时所主要考虑的影响因素基本一致［28－29］.故在设计和筛选引物的过程中，尽量选择Tm值相近的引物进行组合，并设计L16（43）正交试验，进一步选择出了多重PCR的最佳反应体系.本研究建立的快速检测大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR体系，相比常规培养方法具有操作简便、快速、灵敏度高等特点，便于批量检测.因此，使用本方法做样品初筛，结合国家标准或行业标准，可大大缩短检测周期，降低检验成本，更加适应果汁生产和储存过程中的多种污染菌的诊断、检测和监控，尤其在出口果汁的质量控制方面发挥着重要作用，同时为多种果汁污染菌检测试剂盒的研发奠定了基础.参考文献［1］Mansy M S M，Fadl A A，Ashour M，et al.Amplification of Proteusmirabilis chromosomal DNA using the polymerase chain reaction ［J］.Molecular and Cellular Probes，1999，13（2）：133－140［2］陈金顶，索青利，廖明，等.沙门氏菌的invA基因序列分析与分子检测［J］.中国人兽共患病杂志，2004，20（10）：868－871［3］张辉，崔焕忠，何昭阳.应用PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌［J］.中国兽医杂志，2007，9（43）：76－77［4］张玉霞，黄鸣.食品检验中多重PCR技术的应用［J］.中国卫生检验杂志，2008，18（5）：958－960［5］王春平，韦强，鲍国连，等.鸭疫里默氏菌病和大肠杆菌病多重PCR诊断方法的建立［J］.中国兽医学报，2010，30（3）：352－355［6］崔晓燕，陈峰，谭湘凌，等.食源性致病菌多重聚合酶链反应快速检测［J］.现代预防医学，2010，37（3）：519－520［7］Kurabachew M，Engerφ，Sandaa R，et al.A multiplex polymerase chain reaction assay for genus group and species－specific detection of mycobacteria［J］.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2004，49（2）：99－104［8］Jens P，Jurgen e of a species－specific multiplex PCR for the identification of pediococci［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，128（2）：288－296［9］Mahua D，Joseph M A.Development of a multiplexed PCR detection method for barley and cereal yellow dwarf viruses，wheat spindle streakvirus，wheat streak mosaic virus and soil－borne wheat mosaic virus ［J］.Journal of Virological Methods，2008，142（1/2）：17－24 ［10］Peter M V，Carolyn R H，John M B.Demonstration of rapid multiplex PCR amplification involving 16genetic loci［J］.Forensic Science International：Genetics，2008，3（1）：42－45［11］Daniel B L，Silvane M M，Mario S，et al.Trypanosoma cruzi：Multiplex PCR to detect and classify strains according to groups I and II ［J］.Experimental Parasitology，2009，123（4）：283－291［12］Yenny S，Maribeth A C，Charles P W.Multiplex realtime PCR for detection and quantification of mycotoxigenic Aspergillus，Penicilliumand Fusarium［J］.Journal of Stored Products Research，2009，45（2）：139－145［13］Nurhan E，Zafer G，Yeliz Y，et al.Detection of Staphylococcusaureus enterotoxins in sheep cheese and dairy desserts by multiplex PCR technique［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，142（1－2）：74－77［14］徐伟，刘军，李素芳.单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR检测技术的应用［J］.中国食品学报，2009，9（1）：201－207［15］徐兰英，许汴利，马宏.志贺菌6种独立基因的多重PCR检测［J］.郑州大学学报：医学版，2009，44（6）：1218－1221［16］贺显晶，孙东波，周玉龙，等.猪群中7种高发传染病多重PCR诊断方法的建立［J］.畜牧与饲料科学，2010，31（9）：4－5［17］贾怀杰，陈国华，何小兵，等.猪繁殖障碍性疫病多重PCR诊断方法的建立及其应用［J］.甘肃农业大学学报，2010，45（6）：6－11［18］李博，陈福生，王小红，等.多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌［J］.卫生研究，2008，37（4）：438－442［19］陈伟，杨迎伍，邓伟，等.3种致病菌多重PCR检测体系的建立及应用［J］.食品与发酵工业，2008，34（9）：132－136［20］王慧，朱瑞良，谭燕玲，等.多重PCR检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用［J］.中国农业科学，2011，44（11）：2334－2340［21］钱玉春，类延花，胡中旺.3种食源性致病菌的多重PCR检测方法研究［J］.安徽预防医学杂志，2010，16（5）：349－359［22］孙鸿燕.4种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立［D］.长春：吉林大学，2011［23］唐俊妮.金葡萄的耐热核酸相关基因的功能和特征分析［D］.武汉：华中农业大学，2007［24］申志勇.PCR引物特异性评估体系及多重PCR引物设计系统的构建与应用［D］.北京：中国人民解放军军事医学科学院，2009［25］Jung W S，Kim S，Hong S I，et al.DNA probe chip system for multiple detection of food poisoning microorganism［J］.Mater Sci Eng，2004，24（1－2）：47－51［26］YamaZaki K，Teduka H，Inoue N，et al.Specific primers for detection of Alicyclobacillus acidoterrestris by RT－PCR［J］.Letters in Applied Microbiology，1996，23（5）：350－354［27］Bej A K，DiCesare J L，Half L，et al.Detection of Escherichiacoli and Shigella spp.in water by using the polymerase chain reaction and gene probes for uid［J］.Appl Environ Microbiol 1991，57（4）：1013－1017 ［28］赵新，王永，兰青阔，等.4种食源性致病菌多重PCR检测技术的研究及应用［J］.天津农业科学，2009，15（6）：6－8［29］李瑛，黄惠英，张金文，等.兰州百合病毒多重PCR和ELISA检测体系的比较与应用［J］.甘肃农业大学学报，2011，46（3）：59－64（责任编辑许涛）。
多重PCR快速检测三种食品病原菌
网络出版时间：2012-06-01 17:29网络出版地址：/kcms/detail/11.1759.TS.20120601.1729.013.html多重PCR快速检测三种食品病原菌武卫影， 马晓燕* ,张伟(河北农业大学食品科技学院，河北省保定市071000)摘要：建立一种快速、经济、实用的多重PCR方法，同步检测食品中金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法。
根据金黄色葡萄球菌的nuc基因，沙门氏菌的invA基因，小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因，分别设计了三对引物，对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性试验以及优化反应体系。
三对引物能特异性扩增出236、475、129bp的目的条带。
建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度, 灵敏度金黄色葡萄球菌为：102 CFU/mL、沙门氏菌为：102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为：102CFU/mL。
初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR 方法。
关键词：多重PCR，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌Multiple PCR rapid detection for three pathogenic bacteria infoodWu weiying,Ma xiaoyan* ,Zhangwei(Agricultural University of Hebei College of food science and technology, Baoding071000;China)Abstract: Objective To explore a fast, economical and practical multiplex PCR method whichcan detect Staphylococcus aureus, salmonella,Yersinia enterocolitica common food- bornebacterial pathogens simultaneously.Method Three pairs of primers were designed respectivelyaccording to the nuc gene of Staphylococcus aureus,the invasive protein gene (invA) ofSalmonella,the sequence of the ail gene of Yersinia enterocolitica.The specific and sensitiveexperiments were carried out to the amplification of single gene by PCR and Multiplex PCRamplification, and the reaction system were optimized. Conclusions Three DNA fragments of 236,475 and 129 bp were amplified by three pairs of specific primers.Three food borne bacterialpathogens were simultaneously detected by the established multiplex PCR technology. Thesensitivity of this method was for Staphylococcus aureus 102CFU/ml, for salmonella 102 CFU/ml,for Yersinia enterocolitica 102 CFU/ml. Conclusion A triple PCR assay has been established forthe simultaneous sample, rapid and sensitive detection of Staphylococcus aureus, salmonella,Yersinia enterocolitica in food.*通讯作者武卫影（1986-），女，硕士，研究方向为食品中有害物质检测。
三重荧光PCR检测食源性致病菌方法的建立与初步应用
大肠 杆 菌 Ｏ １ ５ ７ 下游 ： Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ＴＦ Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ ｑ ｑ ＇ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ ＡＡ Ａ 拘 ｛ 针： Ｆ Ａ Ｍ． Ｔ ｃ Ａ ｃ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ａ ｃ ＡＡ Ａ Ａ ｃ Ａ ｃ Ｔ １ Ｔ ｒ Ａ Ｔ —
Ｇ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ — Ｂ ＨＱ１ 上游 ： Ｃ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ ＧＡ Ｃ Ｃ Ａ ＧＧ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ｉ ＴＹ
肠杆菌 、 单 增 李 斯 特 杆菌 三 重 荧 光 Ｐ Ｃ Ｒ检测方法 ，
适用 于大 批量 的样 本 检 测 、 突 发 疫情 诊 断 和食 品安 全检 测 ， 对公共 安全 具有 较 大 的意义 。
聚合 酶 链 式 反 应 （ Ｐ Ｃ Ｒ） 技 术 、 基 因 芯 片 技 术 等， 但 这些 方 法 都 不 能 同 时具 备 快 速 、 特异 、 灵敏、
经济 、 简便 等优 点 而未得 到推 广 。 为 了建立 一 种 简 便 、 敏感 、 准 确 可 靠 的快 速 检
测方 法 ， 通 过反 复试 验 ， 建立 了大 肠杆 菌 Ｏ１ ５ ７ 、 志 贺
谢 海燕 ， 蔡 奕琪 ，张端 秀 ，徐振娜 ，洪伟彬
（ 东莞市动物疫病预 防控制 中心 ， 广东 东莞 ５ ２ ３ ０ ８ ６ ）
摘要 ： 根 据大肠杆菌 Ｏ １ ５ ７的 Ｅ基因 、 志贺肠杆菌 ｉ ｐ ａ Ｉ － Ｉ 基 因、 单增 李斯特 杆菌 ｈ ｌ ｙ Ａ基 因的保 守序列 ， 设计 引物和 探 针， 通过优化反应体系 ， 测定其灵 敏度 、 特异性和重复性 ， 建立了可同时检测上述 ３种食源性 致病菌 的多重实时荧 光 Ｐ Ｃ Ｒ方 法 。试验结果显示 ， 该方法对大肠杆菌 ０ １ ５ ７ 、 志贺肠 杆菌 、 单增李 斯 特杆菌进 行 ３联 扩增 的相对灵 敏度检测 限分 别 为 ５× １ ０ 、 ５×１ ０ 和５ Ｘ １ ０ Ｃ Ｆ Ｕ ／ ｍ Ｌ； 对ｌ ０株标 准／ 参考菌株 的检测 结果 ， 只有 目的菌 株呈阳性 反应 ； 用该方法检测 ２ ６份冻 肉样 品 ， 与传 统的细菌分离鉴定法结果一致 ， 说 明研究建 立的方法是鉴定 ３种食 源性致病菌 的有效方法 。
3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用
3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用冯洁;谢建云;胡建华;高诚【摘要】本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)的三重PCR检测方法.根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验.结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368 bp.最佳退火温度在56～59℃之间,引物浓度均为0.2 μmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Mg2+浓度为2.5 mmol/L.3种细菌间无交叉反应.对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应.最低能同时检测到10-5 ng/μL的细菌基因组DNA.3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好.同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出.结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)006【总页数】7页(P1389-1395)【关键词】三重PCR;金黄色葡萄球菌;绿脓杆菌;肺炎克雷伯杆菌【作者】冯洁;谢建云;胡建华;高诚【作者单位】上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203;上海实验动物研究中心,上海市实验动物质量监督检验站,上海201203【正文语种】中文【中图分类】Q78实验动物微生物质量控制是评价实验动物质量的重要指标之一，中国实验动物微生物等级及监测标准GB／T14922.2—2011 中明确规定，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae，K.pneumoniae）是无特定病原体级（specific pathogen free，SPF）实验大、小鼠必须检测和排除的项目。
食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用分析
食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用分析摘要】目的：探讨食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制，并对其应用价值进行详细分析。
方法：分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种食源性致病菌进行多重PCR检测，设计三种特异性引物，对其进行菌多重PCR检测，分析其应用价值。
结果：三种菌固定模板浓度为10-7，可将其优化为三重PCR检测试剂盒，经过相关调试，结果显示，PCR检测试剂盒扩增条件相符，能够进行同时使用。
结论：多重PCR检测试剂盒具有使用便利、灵敏度高、特异性强等优势，将其用在食源性致病菌检测工作中，可及时发现食品安全隐患，是安全检查的核心技术，值得加大研究力度。
【关键词】食源性致病菌；多重PCR检测；试剂盒【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）18-0374-02准确、快速检验食源性致病菌，能够控制致病菌感染和传播。
本研究主要目的为探讨食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制方法，并对其使用价值进行探究，现将研究结果做出如下汇报。
1.材料与方法1.1 材料来源本研究试验菌株来自菌种库，部分则来自实验室分离保存品，所有供研究所用的菌株均要首先进行API（或ATB）细菌鉴定，然后进行正确保存。
试剂：营养琼脂、营养肉汤、细菌DNA提取试剂盒、TES缓冲液；仪器：多重PCR检测仪、电泳仪、光度计、凝胶成像系统（以上均由美国公司提供）。
1.2 试验方法细菌培养：分别取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种食源性致病菌3株标准菌株，将其接种法在营养肉汤的培养基中，在温度为37℃的培养环境中进行过夜培养。
采用细菌试剂盒对三种食源性致病菌基因组DNA进行提取，并使用光度计对其浓度进行准确测定，分别保存在-20℃的环境中。
主要操作程序：取1mL培养物放置于离心管内，以10000r/min速度对其进行离心处理，时间控制在5min，撇去上清液，采用TES缓冲液（500μL）对沉淀物进行洗涤，有效洗涤2次后撇去上清液。
多重PCR快速检测3种食源性致病菌
多重PCR快速检测3种食源性致病菌吴建英;宋建新;曹金萍;涂智杰;余慧宏;胡芹;魏建萍;潘剑【摘要】目的：建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌3种致病菌的多重PCR检测方法。
方法采用LB培养液对金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌标准菌株进行增菌。
根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、产单核李斯特氏菌的hlyA基因、沙门氏菌的invA基因设计引物，通过多重聚合酶链反应(PCR)对上述3种食源性致病菌的目的基因进行扩增，同时对反应体系进行优化。
结果对平均浓度为5cfu/ml的金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门氏菌在LB 培养液中进行8h振荡培养，可以检出阳性结果；把金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、沙门菌、志贺菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌O157、阪崎肠杆菌7种菌混合在一起提取混合基因组DNA进行PCR扩增，显示出很好的特异性结果。
结论建立的多重PCR检测方法适用于金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌的快速检测，具有快速、简便、灵敏的特点，可广泛应用于食品卫生检测、食物中毒应急处理和临床检验等领域。
%Objective To establish a multiplex PCR method for simultaneous detection of Staphylococcus aures, Listeria monocytogens and Salmonella spp. in food. Methods Staphylococcus aures, Listeria monocytogens, and Salmonella spp. were en-riched by LB medium. The primers were designed according to nuc gene of Staphylococcus aures, hlyA gene of Listeria monocyto-gens and invA gene of Salmonella spp. The target genes of these pathogens in food were amplified by multiplex PCR, whose reac-tion conditions were optimized specifically. Results The multiplex PCR method established in this experiment had high specificity while seven kinds of microorganism DNAwere mixed in one PCR reaction tube, and the detection limit of the method was 5 cfu/ml for Staphylococcus aures, Listeria monocytogens and Salmonella spp. Conclusion The multiplex PCR method, which was rapid, convenient and had high sensitivity, could be used in fields such as food sanitation detection, foodborne illness detection and clini-cal inspection.【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】4页(P146-149)【关键词】金黄色葡萄球菌;产单核李斯特菌;沙门菌;多重聚合酶链反应【作者】吴建英;宋建新;曹金萍;涂智杰;余慧宏;胡芹;魏建萍;潘剑【作者单位】江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000;江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000;江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000;江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000;江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000;江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000;江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000;江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000【正文语种】中文【中图分类】R446.5食品中污染的病原菌是引起食源性疾病的主要因素之一。
BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立
2021年第38卷第3期99BVDV 、BRV 和BCoVTaq Man 三重RT-qPCR 检测方法的建立孙亚杰1，关平原1，周伟光1，徐晓静1，希尼尼根1，于景丽2（1. 内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；2. 内蒙古大学生态与环境学院，内蒙古呼和浩特 010021）摘 要：为建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）、牛轮状病毒（BRV ）和牛冠状病毒（BCoV ）的快速检测方法，根据GenBank 中登录的BVDV 5'-UTR 、BRV NSP5和BCoV N 基因序列设计特异性引物和探针，通过优化反应体系和条件，建立了同时检测上述3种病毒的Taq Man 三重RT-qPCR 方法。
该方法仅对BVDV 5'-UTR 、BRV NSP5和BCoV N 基因扩增呈阳性，而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌（A 型、B 型和D 型）、多杀性巴氏杆菌（A 型和B 型）等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性；最低检出限为10拷贝/μL ；组内和组间变异系数均小于2%。
利用本研究建立的Taq Man 三重RT-qPCR 方法对29份临床样品进行检测，获得BVDV 、BRV 、BCoV 的4种混合感染型，其中BVDV 与BCoV 的混合感染率最高（27.6%）；与已有单重RT-qPCR 方法比较，发现两种方法检测BVDV 、BRV 和BCoV 的符合率分别为100%、96.5%、100%。
结果表明，本研究建立的Taq Man 三重RT-qPCR 方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点，可为今后BVDV 、BRV 和BCoV 共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。
关键词：牛病毒性腹泻病毒；牛轮状病毒；牛冠状病毒；Taq Man 三重RT-qPCR ；混合感染中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1005-944X （2021）03-0099-08DOI ：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.03.020 开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Establishment of Taq Man Triple RT-qPCR for Detecting BVDV ，BRV and BCoVSun Yajie 1，Guan Pingyuan 1，Zhou Weiguang 1，Xu Xiaojing 1，Xininigen 1，Yu Jingli 2（1. College of Veterinary Medicine ，Inner Mongolia Agricultural University ，Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment of Animal Diseases ，Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hohhot ，Inner Mongolia 010018，China ；2. School of Ecology and Environment ，Inner Mongolia University ，Hohhot ，Inner Mongolia 010021，China ）Abstract ：In order to establish a rapid method for detecting bovine viral diarrhea virus （BVDV ），bovine rotavirus （BRV ）and bovine coronavirus （BCoV ），the specific primers and probes were designed according to the sequences of 5'-UTR ，BRV NSP5 and BCoV N genes registered in GenBank ，followed by the optimization of reaction systems and conditions ，then the Taq Man triple RT-qPCR was established to simultaneously detect the above three viruses. By which ，positive results only occurred in the amplification of BVDV 5'-UTR ，BRV NSP5 and BCoV N genes ，but negative for infectious bovine rhinotracheitis virus （IBRV ），bovine parainfluenza virus （BPIV ），Clostridium welchii （type A ，B and D ），Pasteurella multocida （type A and B ）and other pathogens related to calf diarrhea ；the minimum detection limit was 10 copies/μL ；and the variation coefficients of intra-and inter-group were less than 2%. 29 clinical 收稿日期：2021-01-21 修回日期：2021-02-05基金项目：内蒙古自治区科技重大专项（2020ZD 0006）；国家自然科学基金项目（31660724）通信作者：希尼尼根。
3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究
3种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究闵文光;余慧宏;魏建萍;涂智杰;吴建英;宋建新【摘要】目的建立一种能同时检测志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157的多重PCR方法.方法根据志贺菌IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]、大肠埃希菌O157 eaeA基因[3,4]设计特异性引物,采用LB对志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157进行振荡培养,通过多重PCR扩增3种病原菌的目的基因,通过优化反应体系,提高反应的检测效率和特异性.结果对志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157振荡培10h,经过PCR反应扩增出目的基因,把志贺菌,副溶血性弧菌、大肠埃希菌O157、肠道致病性大肠埃希菌,产肠毒素性大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌8种菌混在一起提取核酸进行PCR扩增,结果表明此PCR方法具有良好的特异性.结论本研究建立的多重PCR检测方法能快速检测志贺菌,副溶血性弧菌和大肠埃希菌O157,具有快速,灵敏,特异的特点,能广泛应用于食源性疾病检测,食物中毒检测等领域.【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2018(036)004【总页数】3页(P499-501)【关键词】志贺菌;副溶血性弧菌;大肠埃希菌O157;多重聚合酶链式反应【作者】闵文光;余慧宏;魏建萍;涂智杰;吴建英;宋建新【作者单位】景德镇市疾病预防控制中心,江西景德镇 333000;景德镇市疾病预防控制中心,江西景德镇 333000;景德镇市疾病预防控制中心,江西景德镇 333000;景德镇市疾病预防控制中心,江西景德镇 333000;景德镇市疾病预防控制中心,江西景德镇 333000;景德镇市疾病预防控制中心,江西景德镇 333000【正文语种】中文【中图分类】R446.5;Q7微生物引起的食源性疾病中，志贺菌，大肠埃希菌O157与副溶血性弧菌引起的食源性疾病占据了大多数。
传统检测方法的操作步骤过于繁琐，工作量大，检测周期长，不能及时为食源性疾病爆发和食物中毒提供有效的线索[5]。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
基因 注册号
扩增
引物序列 (5′- 3′)
长度
肠毒性大肠埃希菌 LTB NC002128 CTGGTAGTGTCTCGGGTGTGTGGTAGCTTGAGCGGTG 194 bp
沙门菌
invA NC004631 AAGAAGCGTCATCGTTAGTCACGACTCGTATCACAT 279 bp
福氏志贺菌
© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
1960
中国卫生检验杂志 2007年 11月 第 17卷 第 11期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Nov 2007; Vol 17 No 11
[摘要 ] 目的 :建立快速检测食源性致病菌的多重 PCR 方法 。方法 :本研究根据肠毒性大肠埃希菌 ( enterotoxigenic E. coli, ETEC)的大肠杆菌不耐热毒素 (Heat labileenterotoxin, LT)的 B 亚单位 (LTB ) 、伤寒沙门菌 (S alm onella typh i)的侵袭蛋 白 A ( invasion p rotein A , invA ) 、福氏志贺菌 (Sh igella flexneri)侵袭性质粒抗原 H基因 ( invasion p lasm id antigen H , ipaH ) ,分 别设计了三对引物 ,预计 PCR扩增的目的基因片段为 194、279和 435 bp。对单个基因 PCR和单管多重 PCR扩增的特异 性 、敏感性分析以及建立 L16 (43 )正交试验对单管多重 PCR扩增条件如引物浓度 、dNTP浓度和 Tm 值等的优化 ,建立了 快速检测肠毒性大肠埃希菌 、伤寒沙门菌和福氏志贺菌的稳定的单管多重 PCR 方法 。结果 :该方法检测的灵敏度分别 为 : 145 pg /m l肠毒性大肠埃希菌的基因组 DNA、100 ng /m l 伤寒沙门菌的基因组 DNA、7 ng /m l 福氏志贺菌的基因组 DNA,与单基因 PCR检测的灵敏度相同 。并且模拟检测食品中的细菌 ,结果很稳定 。结论 :该方法操作简单 、检验周期 短 、特异性和灵敏度高 ,能够快速地实现对食品中的多种致病菌的诊检和监控 。 [关键词 ] 多重 PCR;食品检验 ;肠毒性大肠埃希菌 ;伤寒沙门菌 ;福氏志贺菌 [中图分类号 ] R15515 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1004 - 8685 (2007) 11 - 1959 - 04
以肠毒性大肠埃希菌的编码 LTB 的基因 ,沙门菌的 invA 基因 ,志贺菌的 ipaH基因为研究对象 ,根据 Genbank中基因序 列 ,应用 Primer 510 引物设计软件设计如下三对特异性引物 (表 1) 。
表 1 多重 PCR 扩增的目的基因名称及序列号及引物设计
菌种
目的 NCB I
将肠毒性大肠埃希菌接种于肠道菌增菌肉汤 、沙门菌接 种于 SC增菌液 、志贺菌接种于 GN 增菌液 [6 ]中进行增菌 ,然后 接种于 EMB培养基上进行纯培养 。挑一单个菌落复接种到 30 m l相应增菌液内增菌 ,提取 1 m l 菌液用甘油保存于 80℃备用 。其余菌液与培养有金黄色葡萄球菌 、霍乱弧菌和 副溶血 弧 菌 的 培 养 液 分 装 于 离 心 管 中 , 5000 r/m in 离 心 1 m in,收集沉淀 , 用 细 菌 DNA 提 取 试 剂 盒 提 取 3 种 细 菌 的 DNA ,用紫外分光光度计测定 DNA 浓度 ,分装数管 , - 20℃保 存备用 。肠毒性大肠埃希菌基因浓度为 145μg/m l,沙门菌基 因浓度为 100μg/m l,志贺菌基因浓度为 70μg/m l。 114 扩增的目的基因及引物设计
ipaH NC008258 GCGGGCATAGTGAACATAAAGCGGTAAGACGTTCAACAC 435 bp
115 单基因 PCR扩增及特异性和敏感性分析 先对 3种菌进行单独扩增 ,反应体系 :模板 DNA 1μl,上 、
下游引物各 1μl(10 pmol/L ) , dNTP 115μl(215 mmol/L ) , Taq 酶 015μl(单位为 5 U /μl) , 10 ×Taq酶 buffer 215μl,M gCl2 溶 液 115μl,其余用无菌的去离子水补足 ,总体积 25μl。 PCR 扩增条件 : 95℃变性 3 m in, 94℃变性 50 s、54℃退火 50 s、72℃ 延伸 50 s,共进行 30个循环 ,最后 72℃延伸 10 m in, PCR 产物 在 115%的凝胶上进行电泳 。将 3个 PCR 扩增产物进行回收 , 然后进行核苷酸序列测定 ,并与 Genbank中发表的相应序列 进行比较 。
[ Abstract] O bjective: To establish and app ly multip le PCR for diagnosing three food - borne bacterial pathogens1M ethods: Three pairs of p rimers have been designed according to the Enterotoxigenic E1coli ( ETEC) heat labileenterotoxin B (LTB ) , S alm o2 nella typh i invasion p rotein A ( invA ) , S h igella flexneri invasion p lasm id antigen H ( ipaH) 1Anticipated PCR p roduct was 194, 279 and 435 bp1The specificity and sensitivity of PCR were analyzed for single gene1M ultip le PCR method has been developed for di2 agnosing ETEC, S a lm onella typh i, S h igella flexneri after analysis and op tim ization reaction condition by orthogonal experimental design L16 (43 ) 1Results: The sensitivity of multip le PCR was 145 pg/m l genome DNA for ETEC, 100 ng /m l for S a lm onella typh i, 7 ng /m l for S higella flexneri, which are same as the sensitivity of single PCR1The results were stable in simulated exam ination. Conclusion: The multip le PCR method is valuable for exp loration and app liacation1 [ Key words] M ultip le PCR; Food inspection; Enterotoxigenic E1coli; S a lm onella typh i; S h igella flexneri
将已经测定浓度的 3种细菌的模板 DNA 按 100 ～10 - 10倍 稀释 ,按照相同的上述条件分别进行 PCR 扩增 ,测定单基因 PCR扩增的敏感性 。 116 单管多重 PCR的扩增反应体系
生物学研究 。
会出现恶心 、呕吐 、腹痛等相似的症状 ,尤其是症状不典型者 , 极容易被相互误诊 ,影响治疗而导致慢性感染或带菌者 。因 此 ,迫切需要对这 3 种病原体进行准确而快速的诊断 。目前 包括我国在内的许多国家对这些致病菌的检验大多仍沿用传 统的对残余食物的细菌培养及鉴定方法 ,检验步骤繁琐 ,检验 周期较长 ,而且检测的灵敏度也较低 。尤其是在应对突发公 共卫生事件上 ,不能够满足诊断及时 、结果准确 、敏感性和特 异性高的要求 [5 ] 。
近年来 , 随着经济全球化进程的加快 , 食品安全已成为 当今世界性公共卫生热点 。食源性致病菌是引起食源性疾病 的首要原因 , 食源性致病菌对人类健康造成极大危害 ,是食品 安全的重大隐患 。据 WHO 估计 ,发达国家每年约 30%的人口 患食源性疾病 [1 ] ,在发展中国家情况更为严重 ,估计每年腹泻 及其相关疾病有 217 亿病例 , 导致 240 万 5 岁以下儿童死 亡 [2 ] 。食源性疾病可以侵犯任何人群 ,儿童 、孕妇 、年老体弱 者和免疫力低下的人群更容易感染食源性疾病 ,成为最主要 的受害人群 [3 ] 。
1 材料与方法 111 菌种
金黄色葡萄球菌 、霍乱弧菌 、副溶血弧菌 、伤寒沙门菌 、福 氏志贺菌 、肠毒性大肠埃希菌由安徽医科大学微生物教研室 和安徽省合肥市疾病预防控制中心提供 。 112 主要试剂及仪器
PCR扩增试剂购自上海 Promega公司 、DNA 提取试剂盒 购自上海赛百盛基因技术公司 、100 bp DNA ladder marker购 自 Takara宝生物工程 (大连 )有限公司 、751 型紫外分光光度 计购自上海光谱仪器有限公司 、DYY - 5型电泳仪由北京市六 一仪器厂生产 、M astercycler梯度 PCR仪购自 Eppendorf公司 。 113 细菌的培养和基因组 DNA 的提取
肠毒性大肠埃希菌 ( enterotoxigenic E1coli, ETEC) ,伤寒沙 门菌 (S a lm onella typh i) ,福氏志贺菌 ( S h igella flexneri)是引起 食源性疾病的常见 3种病原体 [4 ] 。这 3种病原体感染人体都
[基金项目 ] 安徽医科大学校科研基金资助项目 (522562) [作者简介 ] 蔡亦红 ( 1980 - ) ,女 ,硕士 ,助教 ,主要从事卫生微