8哈工大考研 污染控制微生物本科课堂讲义

(二)一般土壤微生物的分离与计数
l．稀释平板法 这个方法操作简便，而且同时从土壤中分离出较多 种类的微生物。稀释平板法是测定土壤中活的微生物 数量最常用的一种方法，本方法的操作步骤如下：
用1/100天秤称取10g土样，加入盛有100mL无菌水的 500mL三瓶中。同时称取待测土样10~11g，经105℃烘 干8h，臵于干燥器中，待冷却后称重，按下列公式计 算土壤含水量的百分数。
ห้องสมุดไป่ตู้
选择5个相连的稀释度，将不同稀释度悬液分别接种 至不同培养基的试管中，每管接悬液1 mL，每一稀释 度均有5管重复；③于28℃培养7～14d，根据各生理群 微生物在其培养基上的生长或反应，分别记录结果。 根据各稀释系列试管中有无待测微生物或其生理反 应的正或负得出数量指标，并根据重复数量不同从相 应的稀释法测数统计表中查出细菌近似值。应用稀释 法计数时，在稀释系列中，必须最后一个稀释度所有 重复间都没有微生物生长。确定数量指标系取稀释系 列中所有重复都有生长（或呈正反应）的最高稀释度 为数量指标的第一位数字。例如：
土壤中的微生物
(微生物数/g土壤)×103 深度/cm 3~8 20~25 需氧菌 厌氧菌 7 800 1 800 1 950 397 放线菌 2 080 245 真菌 119 50 藻类 25 5
35~40 65~75 135~145
472 10 1
98 1 0.5
49 5 -
14 6 3
0.5 0.1 -
表层土几毫米以下，又可防止太阳紫外线对微生物的 杀害，所以，土壤有‚微生物天然培养基‛的称号。 土壤中微生物的数量最大，类型最多，是人类利用微 生物资源的主要来源，也是微生物在自然界中最大的 贮藏库。但土壤也经常受病原体等的污染，在传播疾 病中起一定作用。
(一)土壤微生物的种类 土壤中的微生物包括细菌、放线菌、真菌、螺旋 体、藻类和病毒，还有原生动物。以细菌为最多，占 土壤微生物总数量的70%～90%，放线菌、真菌次之， 藻类和原生动物等的数量较小。绝大部分微生物对人 类是有益的，它们有的能分解动植物尸体为简单的化 合物，供植物吸收；有的能固定大气中的氮，使土壤 肥沃，有利于植物生长；有的能产生各中抗菌素；也 有一部分土壤微生物是动植物的病原体。
土壤中的真菌多属于藻菌纲，如毛霉属，根霉属； 子囊菌纲，如酵母菌；半知菌纲，如青霉属、曲霉属、 镰刀菌属、木霉属、轮枝霉属（Verticilliun）、头孢 霉属（Cephalosporium）、念珠霉属（Monilia）等。 4．土壤中其他微生物 土壤中有许多藻类，大多数是单细胞的硅藻和绿藻。 数量远较上述各类菌少，不到土壤微生物总数量的1 ％，但因形体较大，生物量约为细菌的1/10的。它们 与某些真菌营共生生活。土壤中的原生动物，包括纤 毛虫、鞭毛虫和肉足虫（Sarcodina）等类，它们都是 单细胞的、并能运动的微生物，形体大小差异很大， 通常以分裂方式进行无性繁殖。它们吞食有机物的残 渣，也捕食细菌、真菌及其他微生物。因此，原生动 物的数量与土壤细菌之间常表现相反的关系，即土壤 中的原生动物愈多，则细菌愈少。原生动物对土壤有 机物的分解，有着一定作用。
稀释度 10-1 10-2 5 10-3 4 10-4 2 10-5 0
生长情况
+++++
5
+++++ ++++-
++--- -----
数量指标为542，由表查得细菌近似值为25。如果 在所有重复试管内都有微生物生长的稀释度之后仍有 三个数字，则将最后一个数宇加在前一个数字上。例 如： 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 5 4 2 2 0 则数量指标为544。 计算结果时，可采用以下公式：
土壤悬液的接种方法： 混菌法 吸取lmL悬液于直径9cm的无菌培养皿中， 然 后 倾 注 已 熔 化 并 冷 却 至 45℃ 的 选 择 性 培 养 基 约 15mL与培养皿中的土悬液充分混匀，待凝固倒臵保 温培养。 涂布法 是在事先倾注好的选择性固体培养基表面， 用l mL无菌吸管于琼脂表面加1滴相当于0.05 mL一定 稀释度的土壤悬液，然后立即用玻璃刮刀将悬液均匀 地涂抹于琼脂表面。 接种的培养皿，待培养基凝固后倒臵于28～30℃ 恒温箱中培养，细菌培养3～5d，真菌培养5~7d，放 线菌培养10～14d。然后取出，细菌和放线菌选取出 现菌落数为在20～200个的培养皿，真菌选取菌落数 为10～100个的培养皿。 结果计算分为以下两种情况
污染控制微生物学
第八章 微生物的生态
微生物与环境之间的关系极为密切。环境中的 各种因子影响着微生物的生存和生长繁殖，而微生物 通过新陈代谢等活动也对环境产生着影响。微生物的 生态就是研究微生物以及与微生物相联系的物理、化 学和生物等环境之间的相互关系。
研究微生物的生态，掌握微生物与环境之间的相 互关系，不但可以了解微生物在自然界和各种人工环 境中的分布规律，还为人类利用微生物资源和控制微 生物生存提供了理论依据，更重要的是可以根据微生 物生态学原理，创造有利条件，开发新型的人工生态 系统，以便提高水污染控制工程中人的主观能动性， 达到预期目的，使水污染控制在更高层次上得以发展。
土壤微生物的分离和计数
(一)培养基的制备
土壤中微生物的种类繁多，各类微生物所需的营养 物质也不尽相同。培养基就是按照微生物生长繁殖所 需要的各种营养物质，人工配制而成的营养基质。 培养基的配制要适合微生物的营养特点，注意各 种营养比例，同时要控制好培养条件。分离和计数土 壤中常见微生物的培养基参见有关手册。
用混菌法接种的计算方法如下：
菌落平均数 稀释倍数 每克干土中菌数 干土百分率
用刮刀法接种的计算方法如下：
每克干土中菌数 菌落平均数 稀释倍数 20 干土百分率
2．稀释法
对具有特殊生理功能的细菌，如硝化、反硝化、固 氮、硫化、反硫化和纤维素分解菌等，常采用稀释法计 数，也称最大概率数法，即MPN法。它是根据统计学原 理，用于估算悬液中活体微生物（一般为细菌）浓度的 方法，其操作规程如下：①制备土壤悬液，见稀释平板 法；②根据各类群微生物在土壤中的大概数量
土壤中有噬菌体，能裂解相应的细菌。在某种情况下， 由于噬菌体对根瘤菌的作用，致使豆科植物不能形成 根瘤。土壤中也有肠道病毒，在传播肠道疾病上有一 定的流行病学意义。
(二)土壤微生物的分布
土壤微生物的分布与土壤的结构、有机物和无机 物的成分、含水量及土壤理化特性(颜色、吸附情况、 酸碱度、盐分及CO2浓度等)不同而有差异。 我国土壤 研究所的调查，国内不同地区土壤中微生物的数量有 很大的差别，例如，在我国，西北黑炉土每克细菌总 数为2 050万，放线菌710万，真菌0.7万；而粤南红壤， 每克细菌总数为62万，放线菌60.6万，真菌6.7万。其 差别主要与不同地区土质有关。 总之，不同的土壤类型，不同季节，以及土壤中水 分、温度等的变化，对土壤中微生物的数量、种类及 分布有很大的影响。因此，在检测土壤微生物做出卫
倍乳糖培养基内，另取10-l稀释液10mL，加人10mL双 倍乳糖培养液中；②臵37℃温箱经过24h培养，以下操 作按大肠菌群的常规测定方法进行。 4．产气荚膜杆菌值的测定 按下列步骤进行：①将土壤稀释液臵80℃水浴加热 15min，以杀灭其中的繁殖体；②分别接种10-1 ～10-4 各稀释液lmL于已融化并冷至45℃左右的亚硫酸钠深 层培养基内，混合均匀，迅速将试管臵水中冷却，臵 44℃培养18～24h，观察结果；③若有产气荚膜杆菌生 长，则于深层培养基中出现裂解、混浊和变黑现象； ④挑选黑色菌落涂片染色，可见产气荚膜杆菌的典型 形态（G+杆菌，芽孢多位于菌体的次极端，芽孢小于 菌体）；⑤根据结果，查表即得产气荚膜杆菌值。
3．产气荚膜杆菌的测定 测定产气荚膜杆菌数量，在判断粪便污染土壤的 时间上有辅助的意义。因为产气荚膜杆菌存活时间较 久，发现大量产气荚膜杆菌而大肠埃希氏菌很少时， 则表示土壤非新近的粪便污染，反之，则表示新近的 污染。 4．嗜热菌的测定 嗜热菌主要存在于温血动物肠道内，也大量存在 于有机垃圾中，检出嗜热菌可作为污染的标志。嗜热 菌为需氧芽孢杆菌，发现大量嗜热菌及少量大肠埃希 氏菌，说明土壤已被粪便污染很久，反之，为新近污 染。 5．芽孢菌和非芽孢菌的比值测定 芽孢菌对于外界环境抵抗力强，生存时间较久， 因而发现大量芽孢菌而非芽孢菌少时，说明污染的时 间较久，反之，则为新近污染。
土壤中的微生物
废气
废水
过度开发
化学品
土壤中的微生物
土壤中微生物的生态分布
土壤是微生物生长繁殖及进行各种生命活动的良好环 境，溶解性的有机物和无机物给生物提供所需的一切营养 物质和能量来源；土壤中经常保持着适当的水分、酸碱度 接近中性。土壤的孔隙和土壤水分的多少，直接影响土壤 的通气条件。在水分饱和的土壤中，孔隙中充满水，排斥 了空气，使土壤中基本上处于厌氧状态，有利于厌氧微生 物的生长，在排水良好的土壤中，土壤孔隙中有水，也有 空气，有利于好氧微生物的活动。土壤水不断变动，通气 情况也随着变动，那么好氧微生物和厌氧微生物的相对数 量也就随着变化。温度在一年四季中变化不大，适宜而稳 定，并且在最
湿土重 - 干土 重 土壤含水量(%) 100 湿土重
将盛有10g土样和100mL无菌水的三角瓶放在振荡机上 振荡10min，使土样均匀地散在稀释液中成为土壤悬液。 土壤分散后，吸取lmL土壤悬液到9mL稀释液中，依次 按倍比稀释法，稀释到10-6 。所用吸取悬液的吸管均需 在稀释中反复吹洗几次才可使用。 根据各类微生物在土壤中的数量多少选择适当稀释度， 如细菌为10-4~10-6各重复4次。
（二）检验方法
1．样品的采集与处理 先用灭菌的刀或铲除去土壤的表层，再用烧灼的勺 有采取土壤200～300g，臵于无菌磨口玻璃瓶内，标明 采取地点、深度、日期和时间。 将土壤臵乳钵中研磨均匀，称取50g，加入盛有450mL 灭菌自来水的广口瓶中，充分振摇混匀，制成10－1的 稀释液，然后以此为检验材料，进行细菌总数及大肠 菌群等检测。 2．细菌总数测定 方法与水的细菌总数测定相同。 3．大肠菌群值的测定 测定方法如下：①由稀释倍数高的开始，顺序吸 取10-3、10-2及10-l稀释液各lmL，分别加人10mL单
1．土壤中细菌 土壤中细菌按来源可分为三类： 天然生活在土壤中的自养菌，这类细菌只需要简单的 无机化合物作为养料来维持生命。 随着动物尸体进人土壤的腐物寄生菌，是一类异养菌， 这类细菌的合成能力较差，不能利用CO2或碳酸盐作为 碳源，需要复杂的化合物，其中有些可利用无机氮，有 些则需有机氮作养料，并从分解有机物中获得能量。 随着动植物尸体或其排泄物进人土壤的致病菌，由于 营养要求严格，一般在土壤中容易死亡，只有能形成芽 孢的细菌才能长期存在。 2．土壤中放线菌 放线菌的数量也很大，仅次于细菌，占土壤中微生物 总数量的5％～30％。主要是通过形成无性孢子的方式 进行繁殖。典型的放线菌细胞呈丝状分枝，菌丝体
长短不一，有些长达600 μm以上。放线菌的一个丝状 营养体的体积比一个细菌大几十倍至几百倍，因此， 数量虽较少，但在土壤中的生物量，相近于细菌。放 线菌多生长于耕作层土壤中，数量随着土壤深度增加 而减少。 土壤中的放线菌种类很多，常见的有链霉菌属 (Streptomyces) 、 诺 卡 氏 菌 属 、 小 单 孢 菌 属 (Micromonospora) 和 高 温 放 线 菌 属 （ Thermoactinomyces）。 3．土壤中真菌 真菌广泛生活在近地面的土层中，每克土壤有几 万到几十万个，从数量上看，真菌是土壤微生物中第 三大类。它们在土壤中以菌丝体和孢子形式存在，估 计每克土壤中真菌菌丝的总长可达40m，平均直径为 5μm，则土壤中含活真菌重量约0.6mg/g。
每克干土菌数 近似值 数量指标第一位数的稀 释倍数 干土百分率
设样品含水量为20％，则干土为80%：
25 10 2 100 每克干土菌数 80
土壤的卫生微生物学检测
(一)主要检查项目
1．细菌总数的测定 土壤中微生物种类很多，它们的生物学特性各不 相同，对于培养条件及营养要求也各不相同，因而细 菌培养法显然不能确切的代表土壤中的微生物状态， 而只能大致说明细菌污染程度。 2．大肠菌群值的测定 大肠菌群在自然界中存活时间与肠道致病菌近似， 因此，大肠菌群值的测定，在确定土壤被粪便污染上 有较现实的意义。大肠菌群值的概念，是指可检出大 肠菌群的最小被检样品重，通常用克来表示。